合成的寡核苷酸在合成時(shí)其5'端缺少一個(gè)磷酸基， 因而極易用T4噬菌體多核苷酸化反應(yīng)，這種探針可達(dá)到于γ＝32P從[γ＝32P]ATP本身同樣高的放射比活度。下面所述的反應(yīng)是為對(duì)10pmol寡核苷酸進(jìn)行高比活度的標(biāo)記而設(shè)計(jì)的。通過(guò)擴(kuò)大或縮小這一反應(yīng)的規(guī)模便可成功地標(biāo)記不同量的寡核苷酸，而各成分的濃度則可保持不變。
1）配制下列反應(yīng)混合液：
寡核苷酸（10pmol/μl） 1.0μl
10xT4噬菌體多核苷酸酶緩沖液 2.0μl
[γ＝32P]ATP(比活度5000Ci/mmol;10mCi/ml水溶液)(10pmol) 5.0μl水 11.4μl
10xT4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液
0.5mol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.1mol/L MgCl2
50mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)
1mol/L 鹽酸亞清胺
1mol/L EDTA(pH8.0)充分混勻，在一裝有10μl 10mol/L Tris.Cl(pH8.0)的反應(yīng)管內(nèi)加入0.5μl上述反應(yīng)混合液，擱置一旁留備步驟3）中使用。該反應(yīng)所含[γ＝32P]ATP和寡核苷酸的濃度相等，僅有50％的放射性標(biāo)記物被轉(zhuǎn)移至寡核苷酸。若將反應(yīng)中寡苷酸濃度增至原來(lái)的10倍，可提高轉(zhuǎn)移的效率，其結(jié)果導(dǎo)致近90％的放射性標(biāo)記物轉(zhuǎn)移至寡核苷酸。但是，寡核苷酸的放射性比活度卻會(huì)降至原來(lái)的1/5。如果對(duì)一段寡酸進(jìn)行高比活度標(biāo)記，可以：
a.將反應(yīng)中[γ＝32P]ATP的濃度增加至原來(lái)的3倍（即反應(yīng)混合液中使用15μl放射性標(biāo)記物而水的體積減小至1.4μl。
b.將寡核苷酸濃度減小至3pmol。在這些情況下，僅有約10％的放射性標(biāo)記物被轉(zhuǎn)移，但實(shí)際上每個(gè)寡核苷酸分子都被標(biāo)記。
2）在反應(yīng)混合液中加入8單位（約1μl）T4噬菌體多核苷酸激酶。 充分混勻，于37℃溫育45分鐘。人該反應(yīng)液中另取0.5 μl 加至另一裝有10 10mmol/LTris.Cl(pH8.0)的反應(yīng)管中，擱置一旁留備步驟3）使用。于68℃將其余的反應(yīng)液加熱10分鐘，以滅活T4噬菌體多核苷酸激酶。
3）按下列方法（Stawinski等，1977;Narang等，1980）確定32 P轉(zhuǎn)移至寡核苷酸的效率并估算其比活度：
a.切下一張長(zhǎng)約15cm、寬約5cm的浸過(guò)聚乙烯亞胺（Polygram CEL 300EI：Brinkmann）的纖維素紙條。用一支軟鉛鉛筆在距一端2.5cm 處劃一條橫過(guò)紙條的細(xì)直線(xiàn)，在直線(xiàn)上作兩個(gè)記號(hào)，兩個(gè)記號(hào)間相距約1in(2.54cm)。
b.在兩個(gè)記號(hào)處分別點(diǎn)上步驟1）、2）中擱置一旁的液體各0.5μl，將紙條垂直置于一層析皿內(nèi)，以使放射性樣品處于紙條的下緣。紙條的底部應(yīng)伸入一盛有高度的約為0.5cm的展開(kāi)緩沖液（0.5mol/L碳酸氫銨）的平皿內(nèi)。蓋上層析擄。 使層析展開(kāi)直至溶劑前沿遷移約4－5in（10.16-12.7cm）。
c.將聚乙烯亞胺－纖維素紙條包裹于Saran包裝膜內(nèi)，進(jìn)行放射自顯影，或?qū)⒓垪l水平切成窄（0.25cm）條，在液體閃爍計(jì)數(shù)儀中測(cè)量每一窄條的放射性活度。寡核苷酸仍留在起點(diǎn)處，而ATP和無(wú)機(jī)磷酸將與溶劑作同量方向移動(dòng)，無(wú)機(jī)磷酸較溶劑前沿遷移得稍慢些，而ATP的位置幾乎與起點(diǎn)和無(wú)機(jī)磷酸等距離。這樣，如有磷酸從γ－32P]ATP轉(zhuǎn)移至寡核苷酸，將導(dǎo)致原點(diǎn)樣處出現(xiàn)放射性。 通過(guò)測(cè)量起點(diǎn)處和整張紙條的放射性活度值，便可計(jì)算出從γ－32P] ATP轉(zhuǎn)移至寡核苷酸的放射性標(biāo)記物所占百分比。再根據(jù)反應(yīng)中胡核苷酸和γ－32P] ATP的摩爾數(shù)，便可計(jì)算出探針的比活度。在上述反應(yīng)條件下，應(yīng)有近50％的放射性活度轉(zhuǎn)稱(chēng)至寡核苷酸，結(jié)果比活度接近2500Ci/mmol。轉(zhuǎn)移至寡核苷酸的放射性標(biāo)記亦可通過(guò)用DE－81濾膜吸收法來(lái)測(cè)定。寡核苷酸與帶正電荷的濾膜牢固結(jié)合，而未摻入的放射性標(biāo)記物則可用磷酸鈉溶液反復(fù)洗滌而去除。
4）如果探針的比活度符合要求，則繼續(xù)進(jìn)行放射性標(biāo)記的合成寡核苷棧的純化。如果比活度太低，則另補(bǔ)加8單位酶， 繼續(xù)于37 ℃進(jìn)一步溫育30分鐘（即共75分鐘），并于68℃加熱10分鐘使酶失活，再次分析該反應(yīng)的產(chǎn)物。