１．帶有非互補(bǔ)突出端的片段
用兩種不同的限制酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多數(shù)質(zhì)粒載體均帶有由幾個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)。由于現(xiàn)有的多克隆位點(diǎn)如此多樣，因而幾乎總是能找到一種帶有與外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位點(diǎn)的載體。于是，采用所謂的定向克隆即可將外源ＤＮＡ片段插入到載體當(dāng)中。例如：載體pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ進(jìn)行消化，然后，通過凝膠電泳或大小排阻凝膠層析純化載體大片段，以使同芤下來的多克隆位點(diǎn) 缺小片段分開。于是，這一載體就可以同有與BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ區(qū)段相連接。用得到的環(huán)狀重級(jí)體化大腸桿菌，檢查氨芐青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互補(bǔ)，載體片段不能有效地環(huán)化，所以轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率也極低。因此，大多數(shù)具有氨芐表霉素抗性的細(xì)菌都含有帶外源ＤＮＡ區(qū)段的質(zhì)業(yè)，外源ＤＮＡ區(qū)段成為連接HindⅢ和BamHI位點(diǎn)的橋梁。當(dāng)然，可以根據(jù)特定的外源ＤＮＡ區(qū)段來改變限制酶的組合方式。 如要制備定向克隆載體，它盡量避免使用大多克隆位點(diǎn)上彼此直接相鄰的限制酶切位點(diǎn)。這些位點(diǎn)中的一個(gè)被切開以后，第二個(gè)位點(diǎn)應(yīng)位于線狀ＤＮＡ分子一端的幾個(gè)堿基對(duì)之內(nèi)，這樣過于靠近末端，不利于多種限制酶的有效切割。正因?yàn)槿绱耍詣?wù)必檢查兩種限制酶對(duì)載體的消化是否完全。可采用以下兩種檢查方法： １）用兩種限制酶中的一種對(duì)載體進(jìn)行消化，當(dāng)所用限制酶的最撻緩沖液對(duì)離子強(qiáng)度的要求有不同時(shí)，應(yīng)使用所要求的鹽濃度較低的酶。消化完后，應(yīng)通過凝膠電泳對(duì)一小份ＤＮＡ進(jìn)行檢查。如所有質(zhì)粒ＤＮＡ均從環(huán)狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫�狀分子時(shí)，適當(dāng)調(diào)整鹽濃度，并加入第二種酶。同時(shí)，另行設(shè)立一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，其中含有環(huán)狀質(zhì)粒ＤＮＡ，并只加兩種限制酶中的第二種。當(dāng)預(yù)實(shí)驗(yàn)中的所有ＤＮＡ都轉(zhuǎn)變?yōu)榫�狀（由凝膠電泳確定）時(shí)，通過凝膠電泳或尺墳排阻凝膠層析純化質(zhì)粒ＤＮＡ大片段。\par ２）圖1.7所示的是檢查消化反應(yīng)完全程度的一種更為嚴(yán)格的方法。對(duì)用第一個(gè)限制酶切割的一小份ＤＮＡ進(jìn)行末端標(biāo)記，經(jīng)離盡柱層析法純化后，與未標(biāo)記的線狀ＤＮＡ混合。然后用第二個(gè)酶消化，完全消化可使ＤＮＡ小片段釋放，它應(yīng)帶有50％的放射性活度，這可通過層析或通過凝膠電泳和放射自顯影加以檢測。
２。帶有相同末端（平端或粘端）的片段
帶有相同末端（平端或粘端）的外源ＤＮＡ片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質(zhì)粒載體中。在連接反應(yīng)中，外源ＤＮＡ和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化，也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)ＤＮＡ的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平（見本節(jié)三）．此外，常常使用堿性磷酸酶去除5'磷酸基團(tuán)以抑制質(zhì)粒ＤＮＡ的自身連接和環(huán)化。在體外連接反應(yīng)中，僅當(dāng)一個(gè)核苷酸含5'磷酸基團(tuán)而另一個(gè)含3'羥基時(shí)，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶可催化相鄰核苷間形成磷酸二酯健。用細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)或牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去除線狀ＤＮＡ兩端的5'磷酸可以最大限度的地減少質(zhì)粒ＤＮＡ區(qū)段可有效地與去磷酸化質(zhì)粒ＤＮＡ相連接，產(chǎn)生一個(gè)含有兩個(gè)切口的開環(huán)分子（圖1.8）。因?yàn)榄h(huán)狀ＤＮＡ（即使是帶切口的環(huán)狀ＤＮＡ）的轉(zhuǎn)化效率比線狀ＤＮＡ高得多，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)化體都含有重組質(zhì)粒。
３．帶有平端的片段
外源ＤＮＡ片段帶平端時(shí)，還有一樁切外生枝的麻煩事，這就是蛺端的連接效率比起帶有突出互襪末端的ＤＮＡ要低得多。因此，涉及平端分子的連接反應(yīng)所要求的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的濃度和外源及質(zhì)粒ＤＮＡ的濃度都要高得多。還要說明的是，加入低濃度的如聚乙二醇一類的物質(zhì)，常可提高這類反應(yīng)的效率。