比色法

1.原理
　　固醇類化合物與酸試劑作用，可脫水，發生聚合反應并產生強的顏色反應。

2.適用范圍
　　此方法適用于動物性食物中膽固醇的測定。

3.儀器
（1）實驗室常用設備
（2）分光光度計
（3）電熱恒溫水浴

4.試劑
　　所有試劑，如未注明規格，均指分析純，所有實驗用水，均為蒸餾水。
（1）石油醚
（2）無水乙醇
（3）濃硫酸
（4）冰乙酸(優級純）
（5）磷酸
（6）膽固醇標準（美國Sigma公司）
　　標準儲備液：準確稱取膽固醇100mg，（膽固醇標準開啟后放在干燥器內）溶于冰乙酸中，并定溶至100ml。其濃度為1g/L。可保存2個月。
　　標準工作液：取標準儲備液10ml，用冰乙酸定溶至100ml。其濃度為0.1g/L。此液用時臨時配制。
（7）鐵礬顯色液：
　　儲備液：溶解4.463克硫酸鐵銨［FeNH4（SO4）2·12H2O］于100ml 85%磷酸中貯于干燥器內，此溶液在室溫中穩定。
　　* 鐵礬儲備液須在實驗前兩周配制，因硫酸鐵銨不易溶解，每天要進行短時間的振搖待溶質完全溶于磷酸后再定溶到體積。
　　工作液：吸取儲備液10ml用濃硫酸稀釋到100ml。貯于干燥器內。
（8）氫氧化鉀50%溶液：溶解50g氫氧化鉀于水中，定溶至100ml。
（9）氯化鈉5%溶液：溶解5克氯化鈉于水中，定溶至100ml。
（10）純氮（99.99%）

5.操作步驟

5.1樣品脂肪的提取與測定：根據食物種類分別用索氏提取法、研磨法和羅高氏法提取脂肪，并計算出每100克食物中脂肪含量。

5.2樣品膽固醇的測定：準確稱取提取的油脂3-4滴（約含膽固醇300-500μg） 取樣量可按樣品中膽固醇的濃度增減。置于25ml試管內，加入4ml無水乙醇，0.5ml50%氫氧化鉀，在65℃恒溫水浴中皂化1小時。皂化時每隔20-30分鐘振搖一次使皂化完全。皂化完畢，取出試管，冷卻。加入3ml 5%氯化鈉、10ml石油醚，蓋緊玻璃塞，振搖2分鐘，靜置分層（一般需1小時以上）。

　　取上層石油醚2ml，置于10ml具玻璃塞的試管內，在65℃恒溫水浴中用氮氣吹干，加入4ml冰乙酸，2ml鐵礬顯色液，混勻，放置15分鐘后560-575nm下比色。
5.3標準曲線：準確吸取膽固醇工作液0；0.5；1.0；1.5；2.0ml分別置于10ml試管內，在各管內加入冰乙酸，使總體積達4ml。沿管壁加2ml鐵礬顯色液，混勻，在15-90分鐘內，560-575nm下比色。

6.分析結果
　　樣品中膽固醇含量（mg/100g）=C×V/V'×1/W×F/1000
式中
　　C=測得的光密度值在膽固醇標準曲線上顯示的膽固醇量（μg）
　　V=石油醚總體積（ml）
　　V'=取出的石油醚體積（ml）
　　W=稱取油脂重量（g）
　　F=樣品的脂肪含量（g/100g）
　　1/1000=折算成每100克食物中膽固醇的毫克數。

7.注意事項
　　同一實驗室同時或連續兩次測定結果之差不得超過平均值的10%。