[實驗目的]

通過本實驗學習DNA的限制性內切酶酶切反應的基本原理與實驗技術。

[實驗原理]

1.限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA 分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4 至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少數酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA 片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。 5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3" ；3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA G…5"

2.DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性內切酶本身都會影響限制性內切酶的活性。大部分限制性內切酶不受RNA 或單鏈DNA 的影響。當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用,隨后調節鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc 和2倍體積無水乙醇，混勻后置于-70℃低溫冰箱內30 分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反應。

3.DNA 限制性內切酶酶切圖譜又稱DNA 的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環狀圖式表示。構建DNA 限制性內切酶圖譜有許多方法。通常結合使用多種限制性內切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準確性和精確程度。在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA 用量約為0.5-1μg。限制性內切酶的酶解反應最適條件各不相同,各種酶有其相應的酶切緩沖液和最適反應溫度(大多數為37℃)。對質粒DNA 酶切反應而言, 限制性內切酶用量可按標準體系1μg DNA 加1 單位酶,消化1-2 小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反應時間也要適當延長。

[實驗儀器與設備]

水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐,紫外透射儀,照相系統

[實驗材料]

λDNA; 重組pBS 質料或pUC19 質粒; EcoRI 酶及其酶切緩沖液; HindⅢ酶及其酶切緩沖液;瓊脂糖(Agarose)。

附試劑的配制：

1、 5×TBE 電泳緩沖液：見實驗二。

2、 6×電泳載樣緩沖液：見實驗二。

3、 溴化乙錠：見實驗二。

[實驗步驟]

1.將清潔干燥并經滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA1μg 和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻后加入1μl 酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一 下,使溶液集中在管底。

2. 混勻反應體系后,將eppendorf 管置于適當的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保溫2-3 小時,使酶切反應完全。

3.每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置于冰箱中保存備用。

4.制備瓊脂糖凝膠分析內切酶酶切反應結果

配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10μl 酶解液與2μl 6×載樣液混勻電泳。保持電壓在60-80V，電流在40mA.電泳結束后，用EB染色20-25min,紫外燈下觀察結果。

[作業]

根據紫外燈下觀察的結果，畫出電泳示意圖，并討論內切酶酶切反應應注意的事項。

[實驗安排]

6學時