由于嬰兒配方奶粉生產(chǎn)商需要檢測每批原料和成品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸，因此有必要提供一種快速分析方法。本文所述的基于ACQUITY UPLC/MS/MS的方法由一家大型嬰兒配方奶粉生產(chǎn)商的實驗室開發(fā)；經(jīng)證實，該方法非常靈敏且極其耐用，每天能分析100多個樣本。

近期牛奶和乳制品中含三聚氰胺事件已經(jīng)導(dǎo)致中國數(shù)以千計的兒童患病，有部分患兒死亡。三聚氰胺（1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺；CAS# 108-78-1）常用于塑料、粘合劑、涂料和阻燃劑的生產(chǎn)。三聚氰酸（1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮；CAS# 108-80-5）是三聚氰胺的一種結(jié)構(gòu)類似物，多作為三聚氰胺的雜質(zhì)而被發(fā)現(xiàn)。這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

三聚氰胺因其高含氮量而在中國某些地區(qū)被用以提高牛奶的表觀蛋白含量。人們認為，這兩種化合物相結(jié)合可引起腎毒性。迄今為止，很多監(jiān)管機構(gòu)已經(jīng)提議將其在嬰兒配方奶粉和成人食品中的限量分別定為1.0 ppm（μg/g）和2.5 ppm（μg/g）。美國FDA最近提議1.0 ppm可作為嬰兒配方奶粉成品中三聚氰胺或三聚氰酸的容許量，但規(guī)定這兩種化合物不能同時存在。其他監(jiān)管機構(gòu)（如臺灣）將三聚氰胺的限量降低至0.05 ppm。用于檢測面粉1和寵物食品2中的三聚氰胺和三聚氰酸的方法已經(jīng)進行過介紹，Shia和Diehl描述了使用特殊的SPE對嬰兒配方奶粉3中三聚氰胺和三聚氰酸進行萃取。然而，為確保嬰兒配方奶粉的安全性并盡可能及時滿足監(jiān)管機構(gòu)的檢測要求，我們開發(fā)了一種用于同步測定三聚氰胺（MEL）和三聚氰酸（CYA）的高靈敏、更快速的新型檢測方法，以實現(xiàn)高通量的產(chǎn)品篩查。該方法也適用于分析原料（如酪蛋白或乳清蛋白分離物），從而在用于嬰兒配方奶粉生產(chǎn)前先對其進行核實。同位素內(nèi)標用于校正樣品制備過程中出現(xiàn)的微小偏差，并校正儀器對目標化合物響應(yīng)中存在的基質(zhì)效應(yīng)。

三聚氰胺和三聚氰酸的儲備液分別溶解于100mL水中而配制出濃度為100μg/mL的溶液。混合標準溶液通過用流動相B將三聚氰胺和三聚氰酸儲備液分別稀釋為 2.5μg/mL和5.0μg/mL而制得。混合標準溶液每天現(xiàn)用現(xiàn)配。

三聚氰胺（13C3-15N3-三聚氰胺）和三聚氰酸（13C3-15N3-三聚氰酸）的同位素內(nèi)標以0.1mg/mL水溶液的形式從劍橋同位素實驗室購得。分析當(dāng)天，穩(wěn)定的同位素混合標準溶液通過將同位素內(nèi)標溶液、標準溶液及2%的甲酸乙腈溶液按1:1:2的比例進行混合而制得。

■ 對于原料，稱量1.0g樣品放入一個20mL的玻璃瓶中

■ 添加10.0g水并混勻，使樣品溶解-將溶解后的樣品用作營養(yǎng)品樣品

■ 稱取1.0g產(chǎn)品（粉末或液體）或制備好的原料放入一個20mL的玻璃瓶中。

■ 加入等量的混合內(nèi)標溶液

■ 加入5mL的甲酸水溶液（體積比2%）

■ 通過渦旋混合15秒左右或混合至所有固體均已溶解為止

■ 在第二個20mL的玻璃瓶中放入9mL含10mM醋酸銨的體積比為97/3的乙腈/水溶液

■ 將1 mL制備好的樣品溶液轉(zhuǎn)移至上述第二個玻璃瓶。

■ 混勻

■ 通過一個0.2μm的PTFE濾膜過濾樣品并將濾液收集到進樣瓶中

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世ACQUITY UPLC®

色譜柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC 2.1 x 150，1.7μm

流動相： A：10 mM醋酸銨水溶液   B：溶于97/3乙腈／水的10 mM醋酸銨

弱洗針液： 甲醇

強洗針液： 水

進樣針類型： PEEK

定量環(huán)： 10μL

進樣類型： 滿環(huán)進樣 

 

質(zhì)譜系統(tǒng)： 沃特世ACQUITY? TQD

軟件： 沃特世MassLynxTM 4.1

離子化模式： ESI+

毛細管電壓： 3.50 kV

離子化模式： ESI-

毛細管電壓： 3.00 kV

源溫度： 150℃

脫溶劑氣溫度： 400℃

錐孔氣流速： 50 L/小時

脫溶劑氣流速： 900 L/小時

碰撞氣流速： 0.15 mL／分鐘

包括同位素內(nèi)標在內(nèi)，每個化合物有2個離子通道。第二個通道用于確認，峰面積的比例必須與實際標準品的相匹配才能被認定結(jié)果呈陽性。

 

三聚氰胺和三聚氰酸的校準曲線通過目標化合物和同位素內(nèi)標的響應(yīng)比相對于目標化合物濃度而生成。三聚氰胺（0.25 - 40.0ng/mL）和三聚氰酸（0.50 -80.0ng/mL）的校準曲線均呈線性，儀器得到的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。三聚氰胺和三聚氰酸的校準殘差均低于10%。典型的校準曲線和殘差圖如圖2所示

 

該方法的精準性是通過在方法定量限濃度上對代表性樣品和配料加標進行評估。成品加標量為0.083μg/g三聚氰胺和0.568μg/g三聚氰酸。原料加標量為0.416μg/g三聚氰胺和1.26μg/g三聚氰酸。三聚氰胺和三聚氰酸的回收率均介于90 - 110%之間，四天內(nèi)由多位分析員用兩臺儀器得出的八次獨立測定結(jié)果的相對標準偏差的平均值幾乎都< 10%。結(jié)果匯總于表1。 

 

方法檢出限（MDL）和方法定量限（MQL）根據(jù)40CFR第136部分附錄B所述的方法進行確定。檢出限根據(jù)所測定濃度的標準差計算得出，定量限被定義為檢出限的三倍。在8天內(nèi)用兩臺儀器分別對加標樣品進行分析后，三聚氰胺和三聚氰酸的方法定量限分別被確定為0.039μg/g和0.105μg/g。由于原料分析需要進行稀釋，因此檢出限大約高出10倍。

串聯(lián)質(zhì)譜可在選擇反應(yīng)監(jiān)測（或多反應(yīng)監(jiān)測）模式下進行選擇性檢測。在這種運行模式下，僅可檢出特定母離子/子離子對的化合物。如圖3所示，三聚氰胺的產(chǎn)物離子光譜包含兩個子離子。

在三聚氰胺分析中同時監(jiān)測兩個MS/MS通道而使得方法專一性增強。如果在127→85和127→68 MRM色譜圖中存在相同色譜峰，并且該峰的響應(yīng)比必須在所得到的標準品響應(yīng)比的20%以內(nèi)，那么可以鑒定出三聚氰胺陽性的結(jié)果。標準品（0.25ng/mL三聚氰胺和2.0ng/mL三聚氰酸）、一種非強化型嬰兒配方奶粉和一種強化型嬰兒配方奶粉（0.083μg/g三聚氰胺和0.568μg/g三聚氰酸）的典型色譜圖如圖4所示。 

使用同位素內(nèi)標可大大增強該方法的定量能力和耐用性。通過這種簡單稀釋和進樣程序，每天僅使用ACQUITY TQD即可對100多份樣品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸進行檢測。經(jīng)證實，該方法適合分析95%以上的嬰兒配方奶粉、營養(yǎng)品和蛋白粉樣品。在其他情況下，或者對有共流出干擾的復(fù)雜基質(zhì)，應(yīng)采用一個包括陽離子或陰離子交換SPE的固相萃取（SPE）步驟。 

現(xiàn)已開發(fā)出一種用于同時測定液體和粉末狀嬰兒配方奶以及成人營養(yǎng)品中三聚氰胺和三聚氰酸的快速而耐用的方法，并根據(jù)40 CFR第136部分進行了驗證。成品中三聚氰胺的檢出限和定量限分別為0.013μg/g和0.039μg/g，三聚氰酸相應(yīng)為0.035μg/g和0.105μg/g。對于加標樣品（n=48、8天、兩臺儀器）而言，三聚氰胺（0.083μg/g）的平均回收率和精確度為100.9%，相對標準差6.8%；三聚氰酸（0.568μg/g）為99.1%，相對標準差10.4%。

簡單稀釋后，配備TQ檢測器的ACQUITY UPLC系統(tǒng)可同時對三聚氰胺和三聚氰酸進行快速分析（不到6分鐘）。UPLC?與串聯(lián)質(zhì)譜檢測相結(jié)合提供了卓越的靈敏度和每天分析超過100份樣品的高通量。同位素內(nèi)標的加入在較寬的濃度范圍內(nèi)和各種產(chǎn)品類型中提供了良好的線性和定量效果，從而使三聚氰胺和三聚氰酸的鑒定和定量結(jié)果可信。

所述方法具有快速篩查包括嬰兒配方奶粉的蛋白原料、奶源和營養(yǎng)品的能力，從而可確保生產(chǎn)商和監(jiān)管機構(gòu)能保證產(chǎn)品的安全性和完整性。