一、引言

焦糖色素是一種允許使用的著色劑，我國(guó)對(duì)焦糖色使用量的規(guī)定除個(gè)別產(chǎn)品外均為按生產(chǎn)需要適量使用，其中規(guī)定僅有亞硫酸銨法生產(chǎn)地焦糖色允許使用在碳酸飲料中。而以加氨或其銨鹽制成的焦糖（Ⅲ類(lèi)氨法焦糖和Ⅳ類(lèi)亞硫酸銨法焦糖）會(huì)產(chǎn)生4-甲基咪唑，并且4-甲基咪唑是一種能夠誘發(fā)腫瘤的高水平的化學(xué)物質(zhì)。

焦糖色素被廣泛用于食品以及飲料中，所以4-甲基咪唑的含量監(jiān)控也是必須被重視的，由于4-甲基咪唑分子極性很大，含量很低，所以如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出其含量，就成為人們現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中只有《焦糖色中的4-甲基咪唑的測(cè)定-高效液相色譜法》，而對(duì)于飲料中的4-甲基咪唑則沒(méi)有相關(guān)檢測(cè)方法。

沃特世（Waters®）公司所提供的整體解決方案，同時(shí)來(lái)監(jiān)控飲料中的4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑。使用沃特世SPE的固相萃取策略來(lái)對(duì)于復(fù)雜的樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化，完成對(duì)于4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑的提取濃縮，而沃特世HILIC模式的色譜保留，對(duì)于極性分子的色譜分離提供完美的效果，最后通過(guò)UPLC® H-CLASS PDA以及UPLC/Xevo®  TQ MS的分析，完成出色的定性定量工作。

 
二、實(shí)驗(yàn)條件

樣品前處理方案

固相萃取SPE解決方案——Oasis® MCX (3cc/60mg) 小柱凈化取3g飲料樣品，超聲5分鐘,后待凈化。

活化/平衡

3mL 甲醇 /3mL 水

上3mL樣品

清洗 A: 2%甲酸水溶液/B: 100%甲醇

洗脫 5%氨化甲醇

氮?dú)鈸]干

乙腈:甲醇（9:1）定容

上機(jī)分析

ACQUITY UPLC H-CLASS PDA超高效液相色譜分離條件： 

色譜柱： ACQUITY UPLC®  BEH HILIC Column; 2.1x100 mm,1.7μm

流動(dòng)相 A： 乙腈

流動(dòng)相 B： 5mM 

甲酸銨柱溫： 35˚C

檢測(cè)波長(zhǎng)： 215nm

進(jìn)樣量： 5μL

運(yùn)行時(shí)間： 3min

梯度表： Time (min)  Flow (mL/min)   %A  Curve 

                     0.00       0.5                     80    6

                      3.00      0.5                     80    6

ACQUITY UPLC Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析條件：

色譜柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC Column; 2.1x100 mm,1.7μm

流動(dòng)相 A： 乙腈

流動(dòng)相 B： 5mM 甲酸銨

柱溫： 35˚C

進(jìn)樣量： 2μL

運(yùn)行時(shí)間： 3min

梯度表： Time (min)  Flow (mL/min)  %A  Curve

                   0.00         0.5                   80     6

                   3.00         0.5                   80     6

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 ACQUITY UPLC H-CLASS PDA分析

混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

飲料空白樣品圖

基質(zhì)添加回收色譜圖

3.2 ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS分析

混合標(biāo)準(zhǔn)品TIC

 茶飲料樣品加標(biāo)與空白對(duì)比分析

 可樂(lè)樣品加標(biāo)與空白對(duì)比分析 

通過(guò)分析結(jié)果可以看出，4-甲基咪唑和2-甲基咪唑分子極性很大，一般反相很難保留，多用離子對(duì)試劑來(lái)增加保留，但由于離子對(duì)色譜方式平衡時(shí)間很長(zhǎng)，增加整體分析周期，同時(shí)對(duì)于色譜柱以及儀器的損耗很大，最關(guān)鍵是無(wú)法進(jìn)行有效的質(zhì)譜方法分析。而沃特世公司HILIC模式的極性分析方案可以非常好的進(jìn)行極性分子的保留，流動(dòng)相簡(jiǎn)單，優(yōu)異兼容質(zhì)譜條件，使4-甲基咪唑和2-甲基咪唑有非常好的分離效果以及靈敏度。

同時(shí)由于目標(biāo)化合物極性很大，對(duì)于前處理的要求非常高，分離提取是個(gè)難點(diǎn)，而沃特世公司的固相萃取方案能使樣品達(dá)到非常好的凈化效果，通過(guò)Oasis MCX進(jìn)行保留分離，同時(shí)能夠減少樣品雜質(zhì)對(duì)于色譜柱以及整個(gè)儀器系統(tǒng)的損害。由沃特世ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS所提供的超高效性能以及靈敏度，使得4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的分析達(dá)到理想效果。

四、結(jié)論

4.1.采用ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS可以快速高效地對(duì)4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的含量進(jìn)行測(cè)定，ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA靈敏度可以達(dá)到1mg/kg，ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS靈敏度可以達(dá)到1μg/kg。

4.2.應(yīng)用沃特世固相萃取SPE解決方案配合HILIC模式色譜保留，對(duì)于大極性的小分子有很好的保留以及分離提取的作用，達(dá)到理想凈化效果以及色譜分離效果。

4.3.從樣品前處理到樣品色譜質(zhì)譜分析的整體解決方案，給客戶(hù)提供一體化的服務(wù)解決樣品分析過(guò)程中可能遇到的所有問(wèn)題，幫助客戶(hù)成功！