作者：Michaela Buffler
Buchi實驗室

  歷史上很少有像牛奶這樣的食品與人類密切相關(guān)的。公元5千年前就有家養(yǎng)的奶牛了，而印度奶牛至今被奉為神明。牛奶的味道不僅好，而且它也是健康和營養(yǎng)的食品。實際上，作為最有價值的食品之一，牛奶含有構(gòu)筑肌肉的健康蛋白質(zhì)、強(qiáng)壯骨骼和牙齒的鈣、促進(jìn)消化的乳糖以及強(qiáng)大免疫系統(tǒng)的維他命。牛奶蛋白質(zhì)由于其含有大量的人體必須氨基酸而具有很大的價值，因此它是人體細(xì)胞（如肌肉、器官、皮膚、激素、酶）不可缺少的。
  全世界農(nóng)業(yè)牛奶每年的產(chǎn)量是609百萬噸。最大的牛奶生產(chǎn)地是印度、美國和俄羅斯。歐盟（EU-15）每年生產(chǎn)120百萬噸；因此這也是奶制品的最大的市場。[1][2]
  全世界牛奶的消耗正日新月異的增長著（雖然主要是在奶制品消耗上）。食品企業(yè)用大量的方法處理牛奶，將之轉(zhuǎn)化為不同的產(chǎn)品，從奶酪、糕點以及冰淇淋生產(chǎn)到肉類生產(chǎn)或者膳食處理生產(chǎn)中。[3]
  由于牛奶運輸和奶牛育種值的測定對蛋白質(zhì)含量有很大的影響，因此需要對其進(jìn)行定期測定。
  多年以來，測定蛋白質(zhì)的參考方法一直是凱氏定氮法[4]。這個方法是測定樣品中氮的含量，然后乘以特殊因子（牛奶是6.38）來計算出蛋白質(zhì)的含量。
圖1 Kjedahl K-360
                   
然而，牛奶中也含有其它來源的氮（非蛋白氮化合物=NPN），也包括了所有這些氮，并在蛋白質(zhì)含量中顯示出來。為了去除錯誤，在一些國家已經(jīng)從計算總蛋白質(zhì)含量到計算純蛋白質(zhì)含量。

介紹：
牛奶中蛋白質(zhì)含量
牛奶中總蛋白質(zhì)由大約94%的純蛋白質(zhì)（約3.1g/100g）和約6%非蛋白質(zhì)（約0.2g/100g）組成。總蛋白質(zhì)平均含量為3.3%。
總蛋白質(zhì)
總蛋白質(zhì)由蛋白質(zhì)和其它包括在計算中的非蛋白氮化合物（NPN）組成，
純蛋白
純蛋白由酪蛋白和乳蛋白組成。
（純蛋白=總蛋白-NPN）
NPN（非蛋白氮化合物）
NPN主要由尿素和其它氮化合物（如氨基氮、多肽氮、肌氨酸、角蛋白以及銨鹽等）[5]。

方法
  每個實驗室適用不同的標(biāo)準(zhǔn)用于他們的方法測定（使用傳統(tǒng)的官方建立方法如§35 LMBG, § 64LFGB, AOAC,ISO, EPA和DIN，或者其它官方?jīng)]有要求的但是可節(jié)約化學(xué)試劑、快速處理時間和保護(hù)環(huán)境的方法），這就是為什么采用從原有方法衍生出來修改過的方法的原因。
圖2 H2O2 抽吸模塊
                     
  用H2O2 消解的凱氏過程· 用H2O2 消解法特別適用于高泡沫樣品。然而為了能夠執(zhí)行此方法，需要一個特殊的抽吸模塊（圖2）來滴加H2O2。該抽吸模塊的漏斗是裝有玻璃沙芯，便于H2O2 的勻速流動。
  H2O2 消化的好處：
·節(jié)約50%的消化時間
·消化過程無泡沫
·無重金屬污染，保護(hù)環(huán)境
·用69%的硫酸替代98%的濃硫酸過程：在樣品管中加入5g 牛奶樣品，然后加入10mL H2O2（30%）和30mL 的硫酸（69%）。把H2O2 抽吸模塊放置到
架子上。10min 消化后，再加入20mLH2O2。

微量凱式法
  微量方法與官方方法處理方式一樣。然而，與官方方法相比，這種方法需要更小體積的樣品（1.8mL），更少的化學(xué)試劑量，消化時間也會顯著減少。
  凱氏方法過程（官方方法）
  過程：
  根據(jù)凱氏方法測定蛋白質(zhì)時，牛奶樣品用濃硫酸處理，生成硫酸銨鹽。硫酸銨鹽通過與堿NaOH反應(yīng)，生成氨氣，通過水蒸汽蒸餾被導(dǎo)入到硼酸吸收液中。然后用HCl或H2SO4滴定溶液滴定。
  NPN測定
  NPN測定的第一步就是用三氯乙酸將蛋白質(zhì)沉淀。然后根據(jù)凱氏定氮法分析濾液。
  牛奶直接蒸餾法
  直接蒸餾法是一個簡單快速的測定蛋白質(zhì)的方法，其省略了消化這一步。
  過程：
  取10mL牛奶樣品于樣品管中。開始蒸餾之前，加入20mL氯化鋇（10%）到樣品中，然后采用與官方方法相同的過程。
牛奶樣品在堿性溶液中加熱，然后釋放出氨氣。由于蛋白質(zhì)的組成部分谷氨酸和丙氨酸的快速水解生成大部分的氨氣。該反應(yīng)過程只需幾分鐘即可完成。另外，少量的氨氣是由其它氨基酸完全分解而生成，但是這種分解速度很慢，不會影響該過程。該方法需要測定一個系數(shù)（轉(zhuǎn)換系數(shù)）以簡單地測定個氮和蛋白質(zhì)含量。使用直接蒸餾方法，可以在10min內(nèi)就可測定蛋白質(zhì)含量。

表1 配置

上述儀器用于該文章中描述的應(yīng)用中，也可以使用其它來自Buchi 公司的蒸餾和消解儀。

表2 消化參數(shù)


表3 蒸餾參數(shù)

表4 滴定參數(shù)

為了測定低濃度氮含量樣品（<10mg N），為了能夠更好的檢測轉(zhuǎn)折點，推薦使用低濃度的硼酸溶液（如2%，參見微量方法）。選擇適當(dāng)?shù)臉悠焚|(zhì)量/體積和滴定溶液的濃度，滴定溶液的消耗大約是5~20mL。

表5 結(jié)果

牛奶包裝盒上的標(biāo)示以g/mL為單位，這個標(biāo)示值不能直接與獲得的結(jié)果(g/g=%)做比較。因此雖然這個記過可以用于比較，但是不同的方法也可以與官方方法做比較。

結(jié)論
從上表可看出，優(yōu)化的方法可獲得重復(fù)性好的結(jié)果。這就意味著這些方法可作為大有益處的替代方法以進(jìn)行實驗室常規(guī)過程。
所有文章中提到的方法能夠得到良好的結(jié)果。因此實驗室可以選擇適合自己要求的方法，如微量凱氏方法可以盡可能的減少化學(xué)物的使用，H2O2消化方法是為了獲得快速而且準(zhǔn)確的結(jié)果，或者直接蒸餾法是為了盡快的獲得結(jié)果。然而，當(dāng)需要強(qiáng)制使用官方方法（如AOAC，DIN），是不能夠使用優(yōu)化方法的。