北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所科威華公司王珂  溫凱李東 100054
 

  食物過(guò)敏原可以定義為包含在食物中引發(fā)或激起過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)，在Ⅰ型IgE應(yīng)激的過(guò)敏反應(yīng)中，過(guò)敏原通常是在特定食品中含有的含量豐富、天然存在的蛋白質(zhì)。
  隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國(guó)際化，食品過(guò)敏問(wèn)題具有更大的潛在危險(xiǎn)性，因此建立可靠、定量的過(guò)敏原檢測(cè)方法對(duì)于確保食品標(biāo)簽的一致性和消費(fèi)者的安全十分必要。然而因?yàn)槭澄镞^(guò)敏原在食品中的含量少以及可能被食品基質(zhì)包裹等原因，食物過(guò)敏原的生物活性的檢測(cè)十分困難，另一個(gè)檢測(cè)問(wèn)題是檢測(cè)方法的靈敏度，一般來(lái)說(shuō)，不同食物中檢測(cè)極限要求在1—100ppm（每kg食物中含mg量級(jí)過(guò)敏性蛋白）。
    幾乎所有的過(guò)敏原（抗原）都是蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，多肽分子量一般在5-70KDa之間，也有一些過(guò)敏原分子量超過(guò)200KDa以上。某種食物或食物制品是否存在致敏性，通常是依據(jù)確診敏感個(gè)體血清中鍵合的IgE來(lái)判斷，一旦過(guò)敏原可以確認(rèn)和純化，就可以在兔子、老鼠、山羊、綿羊或雞這些動(dòng)物中獲取抗體，為常規(guī)食品分析提供免疫檢測(cè)方法。
    現(xiàn)在，檢測(cè)食物成品中潛在過(guò)敏原有幾種技術(shù)上的可能性，采用的方法包括直接檢測(cè)過(guò)敏原（蛋白質(zhì)）自身或檢測(cè)引起食物過(guò)敏可能的標(biāo)志物，如果理想的標(biāo)志物就是過(guò)敏原蛋白，其化學(xué)特性不能很好表達(dá)或檢測(cè)極限達(dá)不到要求，則檢測(cè)過(guò)敏原不可行。另外，許多致敏食物中包括多種過(guò)敏原蛋白，含量也有所不同。作為潛在過(guò)敏食物制品或成分的標(biāo)記物，特定的蛋白質(zhì)或DNA片段可以作為靶記進(jìn)行檢測(cè)。以檢測(cè)蛋白為基礎(chǔ)的方法通常包括免疫化學(xué)檢測(cè)方法，例如RAST(radio-allergosorbent test)、EAST（enzyme allergosorbent test）、RIE（rocket immuno-electrophoresis）、免疫印跡（immunoblotting）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）。其中RIE和免疫印跡方法是定性和半定量方法，RAST、EAST和ELISA是定量分析方法。現(xiàn)在只有ELISA法因其準(zhǔn)確性高、易操作和標(biāo)準(zhǔn)化的可能性等，在常規(guī)食品分析中常用。DNA水平上的測(cè)試方法是依照多聚酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）來(lái)識(shí)別特定的DNA片段，實(shí)時(shí)（real-time）PCR方法可以得到高精確度的檢測(cè)結(jié)果。
    檢測(cè)方法的選擇主要考慮所測(cè)試的食品特性（有無(wú)可檢測(cè)的特定抗體或DNA以及可達(dá)到的檢測(cè)極限）以及食品制造過(guò)程的加工歷史等。以蛋白或DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，不同的食物成品的檢出和定量檢測(cè)上有各自的優(yōu)、缺點(diǎn)。對(duì)于以DNA為檢測(cè)對(duì)象的過(guò)敏原檢測(cè)有不同爭(zhēng)議，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是過(guò)敏原成分而加工過(guò)程會(huì)對(duì)蛋白、核酸等產(chǎn)生不同影響。
    下面就幾種常用的檢測(cè)和定量方法進(jìn)行討論：
 
RAST/EAST (radio-allergosorbent test/enzyme allergosorbent test）
    RAST/EAST主要應(yīng)用于食物過(guò)敏的臨床診斷，同時(shí)也應(yīng)用于食物過(guò)敏原的定性檢出以及多品種食物中潛在致敏性的評(píng)價(jià)。也有少量使用RAST法進(jìn)行過(guò)敏原的定量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道，檢測(cè)限為1mgkg-1。RAST或EAST的檢測(cè)原理是抗原或過(guò)敏原在固定相上與特定的人類抗體IgE鍵合，樣品中的抗原與固定相上的抗原競(jìng)爭(zhēng)鍵合IgE，一種抗IgE的抗體用同位素（）或酶（，如過(guò)氧化物酶）標(biāo)記，加入可以改變顏色或能發(fā)光的底物用來(lái)檢測(cè)鍵合IgE的抗體量，鍵合的IgE用γ-計(jì)數(shù)器或分光光度計(jì)來(lái)定量檢測(cè)。此兩種方法的最大缺點(diǎn)是無(wú)法獲取過(guò)敏人群的血清以及評(píng)價(jià)方法的標(biāo)準(zhǔn)化困難。
 
RIE （rocket immuno-electrophoresis）
    RIE使用含有凝膠的抗體，被分析的抗原按照自身的電泳能力在凝膠中移動(dòng)直到抗體和抗原結(jié)合，所形成的電泳峰高與檢測(cè)抗原量成比例。RIE法檢測(cè)不同食品中的幾種抗原的檢測(cè)極限約為2.5-30 mgkg-1。該方法的局限是實(shí)驗(yàn)所需的凝膠制備和免疫環(huán)節(jié)的操作程序比較復(fù)雜。
 
免疫印跡（IB） （immunoblotting）
   點(diǎn)式免疫印跡測(cè)試法主要用于簡(jiǎn)單或廉價(jià)食品樣品的檢測(cè)，提取的樣品蛋白噴灑在硝化纖維膜或PVPF膜上，用特定的與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體進(jìn)行酶標(biāo)記，酶與底物反應(yīng)呈現(xiàn)出有顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)的深淺與抗原的含量成比例。這種方法是半定量測(cè)量方法，但對(duì)某些食物（如花生）中的蛋白檢出限可達(dá)到2.5 mgkg-1。
 
ELISA   （enzyme-linked immunosorbent assay）
    現(xiàn)在ELISA是食品工業(yè)和政府食品管理部門進(jìn)行食品中潛在過(guò)敏原檢測(cè)和定性最常用的方法，用這種方法特定的蛋白或抗原可以與特定的酶標(biāo)記的抗體鍵合后用顯色反應(yīng)來(lái)定性和定量，靠標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算抗原的含量。
    ELISA的檢測(cè)方式有兩種：競(jìng)爭(zhēng)式（competitive）ELISA法和夾心式（sandwich）ELISA法，后者是最常用的食物過(guò)敏原的免疫評(píng)價(jià)方法。
    夾心式ELISA方法是用固定在固定相上的捕獲抗體，樣品中特定的蛋白被第一個(gè)抗體捕獲，然后被第二個(gè)特定的以酶標(biāo)記的抗體檢出，而第二個(gè)抗體與被分析物鍵合，從而形成夾心式。與第二個(gè)抗體相連的酶與特定的底物反應(yīng)形成有顏色的產(chǎn)物，它的吸收峰與被分析物的濃度線性相關(guān)。此種方法用于多種食物過(guò)敏原的檢測(cè)，有多種檢測(cè)工具包上市。
    競(jìng)爭(zhēng)式ELISA方法是測(cè)定相對(duì)較小蛋白質(zhì)優(yōu)先選擇的方法。它包含一個(gè)鍵合在固定相上的固定抗原，血清和一定比例稀釋樣品提取物（作為抑制劑）培養(yǎng)后添加到固相抗原上。如果樣品中沒(méi)有抗原出現(xiàn)，酶標(biāo)記的抗體表現(xiàn)出與固定相上鍵合的抗原的最大鍵合能力，形成的有顏色的產(chǎn)物的最大吸收。因?yàn)闃悠分械目贵w抑制酶標(biāo)記的抗體與固定的抗原的鍵合，吸收峰與樣品中抗原的濃度成反比。有報(bào)道，使用競(jìng)爭(zhēng)式ELISA方法對(duì)某些食物過(guò)敏原的檢測(cè)極限可以低至0.4μg kg-1。
纖維素試紙測(cè)試
    纖維素試紙測(cè)評(píng)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)可以代替ELISA方法的一種測(cè)試方法，它具有價(jià)格低、快速、方便攜帶、無(wú)須儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。目前，試紙測(cè)試只是定性方法，有改進(jìn)的用于測(cè)定雞蛋中過(guò)敏原的試紙測(cè)定方法，具有高度的專一性和靈敏度，檢測(cè)限低至0.02 mgkg-1。
 
PCR多聚酶聯(lián)反應(yīng)
    以DNA為測(cè)試對(duì)象的檢測(cè)方法越來(lái)越多地應(yīng)用到外來(lái)食物的檢測(cè)中，如轉(zhuǎn)基因谷物等。PCR方法對(duì)食物中特定過(guò)敏原的檢測(cè)具有專一性和靈敏度，但是，PCR方法不能檢測(cè)抗原或特定蛋白，因此檢測(cè)結(jié)果不能與食物的真正過(guò)敏性相關(guān)聯(lián)，而且食品加工過(guò)程對(duì)蛋白和DNA的影響不同，在一些加工工序中蛋白和DNA可能被分離，因此產(chǎn)品中是否有過(guò)敏原，以PCR方法的檢測(cè)結(jié)果作判斷可能產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)論。PCR方法的優(yōu)點(diǎn)在于，以DNA為測(cè)試對(duì)象的方法與以蛋白質(zhì)為測(cè)試對(duì)象的方法相比，熱變性條件下目標(biāo)DNA可以有效提取而不象蛋白提取時(shí)受食物基質(zhì)的影響較大；它的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它的穩(wěn)定性，它不象蛋白質(zhì)組成那樣受地理?xiàng)l件和季節(jié)變化的影響。
    特定的DNA片段，側(cè)鏈連接兩個(gè)被熱穩(wěn)定的多聚酶化學(xué)修飾的低聚核苷酸作為測(cè)定反應(yīng)的初始物，測(cè)定反應(yīng)每一個(gè)修飾循環(huán)包括三個(gè)作用步驟。
    普通PCR方法測(cè)試結(jié)果只是定性方法，然而選擇合適的內(nèi)標(biāo)物，可以進(jìn)行半定量分析測(cè)定，更好的定量方法可以使用即時(shí)（real-time）PCR方法或PCR-ELISA聯(lián)用方法。
    即時(shí)PCR方法與其他DNA定量方法相比，即時(shí)PCR方法需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，但準(zhǔn)確度高，勞動(dòng)強(qiáng)度低。即時(shí)PCR方法不用凝膠制品而使用特定目標(biāo)的低聚核苷酸探子，因而實(shí)現(xiàn)即時(shí)分析。
    PCR-ELISA聯(lián)用方法是用特定的以DNA為基礎(chǔ)的方法與相當(dāng)方便和經(jīng)濟(jì)的ELISA測(cè)定方法結(jié)合用于半定量分析的分析方法。使用PCR-ELISA聯(lián)用方法，致敏食物中特定的DNA片段被化學(xué)修飾，修飾物與特定的DNA探子標(biāo)記的特定蛋白相結(jié)合，標(biāo)記蛋白與特定的酶標(biāo)記的抗體偶合，以酶-底物反應(yīng)形成的顏色反應(yīng)來(lái)定量測(cè)定DNA的濃度。
 
生物探測(cè)器
    使用生物探測(cè)器是另一項(xiàng)還未普及應(yīng)用到食品分析中的技術(shù)。生物探測(cè)器儀器可以即時(shí)測(cè)定特定分子之間的反應(yīng)。把一個(gè)目標(biāo)分子（可能是抗體（蛋白）或DNA片段）固定到傳感器的表面，然后定量測(cè)定一個(gè)或兩個(gè)分子間的鍵合反應(yīng)。這種技術(shù)的特點(diǎn)是分析時(shí)間短、自動(dòng)化程度高。生物探測(cè)器技術(shù)可以用來(lái)測(cè)定特定的蛋白質(zhì)或過(guò)敏原，也可以用于測(cè)定特定的DNA片段。該技術(shù)已用于榛子、雞蛋和牛奶中過(guò)敏原的檢測(cè)。