手機版
出廠檢驗常見微生物指標檢驗方法
在我國的32大類食品生產許可中大都有菌落總數和大腸菌群的出廠檢驗的規定，菌落總數和大腸菌群作為食品中安全指標，也是影響產品質量問題的常見指標，常常受到生產企業和消費者的高度關注。
今天，小編就帶大家一起來詳細的了解下食品中菌落總數和大腸菌群檢測方法。
菌落總數
食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度和培養時間等）培養后，所得每g（ml）檢樣中形成的微生物菌落總數。
菌落總數的測定
1
檢驗標準:
GB 4789.2-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定
菌落總數:
食品檢樣經過處理，在一定條件下(如培養基、培養溫度和培養時間等)培養后，所得每g檢樣中形成的微生物菌落總數。
制備1:10樣品勻液
稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水水的無菌均質杯內8000 rimin- 10000r/min均質1 min-2 min.或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質袋中。用拍擊式均質器拍打1min~2 min。制成1:10的樣品勻液。
制備1:100樣品勻液
用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL沿管壁慢慢注入盛有9mL稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭不要觸及稀釋液面) ，振搖試管或換用支無菌吸管反復吹打使其混合均勻。制成1:100的樣品勻液。
制備10倍品勻液
按上一步操作程序。制務10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。
取樣并制備平板
選擇2個一3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液) ，在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個釋釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內空白對照。
及時將15mL-20mL冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基(可放置于46℃士1℃恒溫水浴鍋中保溫)傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。
2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃士1℃培養48 h+2h。
2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋薄層瓊脂培養基(約4mL)，凝固后翻轉平板，按2.1條件進行培養。
3.1 應對平皿上所有肉眼可見的菌落進行計數
3.2 平板上菌落計數可使用自動化菌落計數儀,也可用肉眼觀察(必要時可用放大鏡觀察)記錄培養基上菌落數量和相應的稀釋倍數。
3.3 選取菌落數在30-300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。
3.4 如果在一個稀釋度的兩個平板中,一個平板的菌落數在30-300之間,另一個大于300或小于30時,則以30-30之間平板菌落數作為本稀釋度結果記錄。
3.5 如所有平板的菌落數均在30CFU以下,則記錄平板中具體的菌落數;如果沒有菌落生長,則記錄為小于1CFU。
3.6 如平板上菌落數大于300CFU,則記錄為多不可計;但如果所有稀釋度的平板上落數均大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數、其他稀釋度平板記錄為多不可計。
3.7 同一稀釋度的兩個平行平板中,一個平板有較大片狀落生長時、應不進行計數，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數。
3.8 如果同一稀釋度的兩個平行平板均有片狀菌落生長,選取片狀菌落不到平板一半，而剩余一半落分布均勻的平板,計數一半平板落數并乘以2代表全皿菌落數。
3.9 當平板上出現菌落同無明顯界線的狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。
4.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在30-300CFU之間,計算兩個平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每g(mL)樣品中菌落總數結果。
4.2 若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
4.3 若所有稀釋度的平板菌落數均大于300CFU,則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
4.4 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
4.5 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30-30CFU之間,其中一部分小于30CFU或大于300CFU時,則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
4.6 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,除30-300FU范圍之外的平板,按如下公式計算:
5.1 菌落計數以落形成單位(colony-forming units，CFU)表示,稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以 CFU/ml為單位報告,表面取樣以 CFU/cm2為單位報告。
5.2 菌落數小于100CFU時，按”四舍五入”原則修約，以整數報告。
5.3 菌落數大于或等于100CFU時,將第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用0代替位數,也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數字。
5.4 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數,則報告菌落延。
5.5 若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結果無效。
注：菌落總數結果計算與報告方式實例見表2.1
大腸菌群
主要來源于人畜糞便，是以糞便污染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。
01
大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。
調查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環境中則以大腸菌群其他型別較多。
02
大腸菌群的測定
GB 4789.3-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數 MPN法
固體和半固體樣品:
·稱取25g樣品,放入盛有225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯 內 ,8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無 菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。
液體樣品:
·以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶 (瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。
·用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖 液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。
·根據對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。
每個樣品,選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料 LST肉湯),36 ℃± 1 ℃ 培養24h±2h,觀察倒管內是否有氣泡產生,24h±2h產氣者進行復發酵試驗(證實試驗),如未 產氣則繼續培養至48h±2h,產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。
用接種環從產氣的 LST 肉湯管中分別取培養物1 環,移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中, 36 ℃±1 ℃培養48h±2h,觀察產氣情況。產氣者,計為大腸菌群陽性管。
按3確證的大腸菌群 BGLB陽性管數,檢索 MPN 表(見附錄 B),報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。
GB/T 4789.3-2003 食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群測定
·制備1:10樣品勻液
以無菌操作將檢樣25g(mL)放于含有225mI.滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振搖或研磨做成1 : 10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8 000 r/min~10 000 r/min的速度處理1 min,做成1 : 10的均勻稀釋液。
·制備1:100樣品勻液
用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL,注入盛有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管中，振搖試管混合均勻，制成1:100的樣品勻液。
·制備10倍品勻液
領取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。
·移取樣品
根據食品衛生標準要求或對樣品污染情況的估計,選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三。
將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管，lmL及以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種三管，置36 ℃± 1 ℃培養24 h±2 h,如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36 ℃± 1 ℃溫箱內，培養18h~ 24h,然后取出，觀察菌落形態，并做革蘭氏染色和證實試驗。
伊紅美藍瓊脂:伊紅Y和美藍抑制絕大部分革蘭氏陽性菌的生長.伊紅Y為酸性染料，美藍為堿性染料，瓊脂是凝固劑。大腸菌群發酵乳糖產酸時，細菌帶正電荷，所以染上伊紅(紅色)，再與美藍結合形成紫黑色菌落，大部分有金屬光澤。
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1- 2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置36 ℃± 1 ℃培養24 h±2h,觀察產氣情況，凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。
根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每100mL (g)大腸菌群的MPN值。
