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1.菌種保藏步驟

1.1挑選特征典型的純菌菌落。其方法是用接種環(huán)挑取少許菌苔，接種至2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%氯化鈉溶液中制成菌液，再取一環(huán)菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后可見(jiàn)單個(gè)菌落生長(zhǎng)。

1.2凡能產(chǎn)生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進(jìn)行保種。孢子和芽胞的代謝作用較弱，但對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗。在傳代前，將菌液管放入80℃水浴中作用30分鐘，殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。  

1.3定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退，檢查項(xiàng)目包括菌落形態(tài)、染色、鏡檢、生化特性及血清學(xué)檢查。

1.4選擇適宜的培養(yǎng)基及保藏方法。

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2.常用菌種的保藏方法

2.1普通瓊脂斜面  用于常用菌株的傳代。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。接種培養(yǎng)后，將菌種管用硅膠塞塞緊，置4℃冰箱保存，每隔2～3個(gè)月傳種1次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，其菌種須放25℃培養(yǎng)箱內(nèi)保存。

2.2半固體瓊脂  用于常用菌株的傳代。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養(yǎng)后，置4℃冰箱保存，6個(gè)月傳種1次。如在培養(yǎng)管內(nèi)加少量無(wú)菌液體石蠟隔絕空氣，減少水分蒸發(fā)，可延長(zhǎng)菌種的保藏期。

2.3真菌瓊脂斜面  用于真菌的傳代。在真菌培養(yǎng)基內(nèi)按1.3%加入瓊脂粉配制而成。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。

2.4沙氏瓊脂斜面  用于真菌的傳代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，瓊脂粉13g，加蒸餾水1000mL，待上述成分溶化后，搖勻分裝，115℃滅菌20分鐘，趁熱擺成斜面。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。 

2.5 40％甘油水  用于細(xì)菌的傳代。配制方法：甘油40mL加水至100mL即成。分裝至試管內(nèi)，每支2mL左右，121℃滅菌20分鐘備用。接種細(xì)菌后直接放4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。  

2.6需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基  用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1mL至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基15mL內(nèi)，30～35℃培養(yǎng)18～24h，置4℃冰箱內(nèi)保存3～6個(gè)月傳種1次。  

2.7 皰肉培養(yǎng)基  用于破傷風(fēng)梭菌的傳代。取破傷風(fēng)梭菌CMCCB64067菌液0.1mL接種于皰肉培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)3～4天，置4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。  

2.8 液氮超低溫保藏法  適用于各類(lèi)微生物的保藏。液氮溫度可達(dá)-196℃，此時(shí)菌種的新陳代謝活動(dòng)已停止，但不會(huì)死亡。在配制好的菌液內(nèi)加10％甘油作為保護(hù)劑，分裝于安瓿中，置液氮罐內(nèi)可保存10年之久。

2.9冷凍真空干燥保藏法  本法廣泛適用于各類(lèi)微生物的保藏，包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護(hù)作用的介質(zhì)內(nèi)，分裝于滅菌菌種管內(nèi)，速凍后抽真空，使菌液很快變?yōu)槭杷傻母稍锞�粉，最后在真空狀態(tài)下密封管口，菌種保存期最長(zhǎng)可達(dá)20年以上。

2.10常用菌種的保藏條件及傳種時(shí)間，見(jiàn)表1。

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3．菌種檢查與復(fù)壯

菌種在傳代保藏過(guò)程中，易發(fā)生衰退、變異、污染和死亡，因此必須定期檢查。將菌種接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)使之復(fù)活，重新分離，純化形成單個(gè)菌落，再作菌種鑒定，包括菌落形態(tài)、顏色，染色性、鏡下觀察菌體形態(tài)等，必要時(shí)可做生化試驗(yàn)及血清學(xué)反應(yīng)。

菌種經(jīng)人工傳代保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變而引起特性變?nèi)趸蛳�失往往為菌種衰退。使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性，稱(chēng)為菌種復(fù)壯。常用方法有：

①分離純化：將菌種接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，取菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后挑取典型單個(gè)菌落。  

②宿主復(fù)壯：將退化菌種接種到相應(yīng)昆蟲(chóng)或動(dòng)植物宿主體內(nèi)，傳種數(shù)代可恢復(fù)其原有的特性與毒力。

③抗逆復(fù)壯：通過(guò)極端的逆境處理使那些退化的細(xì)菌死亡，選育健壯的傳代保種。

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4．實(shí)驗(yàn)菌種的管理

菌種應(yīng)放入專(zhuān)用冰箱，實(shí)行雙人、雙鎖保管。菌種應(yīng)有購(gòu)入記錄，傳代記錄，領(lǐng)用記錄和銷(xiāo)毀記錄。菌種應(yīng)定期檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退。菌種傳代應(yīng)不超過(guò)五代。 

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一、為避免污染造成的損失，在凍存細(xì)胞前，應(yīng)該檢查細(xì)胞是否污染以及細(xì)胞的密度和細(xì)胞的活力。

二、細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞的活力。緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶的形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

三、操作步驟

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(一)細(xì)胞凍存

1.配制含10%DMSO、10-20%小牛血清的凍存細(xì)胞培養(yǎng)液；

2.用胰蛋白酶將選好的細(xì)胞消化下來(lái)，消化時(shí)一定要掌握好消化的時(shí)間，如果時(shí)間處理不當(dāng)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，且細(xì)胞瓶中的胰酶殘留盡量倒干凈；

3.將消化好的細(xì)胞加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用注射器或吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻；

4.將細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，每管1~1.5mL；

5.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者；

6.凍存的過(guò)程：將凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱過(guò)夜，取出凍存管移入液氮容器內(nèi)。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1.佩戴厚點(diǎn)的手套，從液氮罐中取出凍存管快速直接放入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)使其在1分鐘內(nèi)快速融解；

2.在無(wú)菌下從水浴中取出凍存管，凍存管用75%酒精擦拭消毒后，打開(kāi)蓋子，用吸管或注射器吸出細(xì)胞懸液注入離心管中，由于離心管中細(xì)胞懸液較少所以再加入適量的培養(yǎng)液混勻；

3.離心，在1000rpm離心5min；

4.將離心管取出，棄去上清液，向離心管中加入含10%小牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液用吸管或注射器吹打后接種于培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜止置培養(yǎng)；

5.7~8小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)。

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四、注意事項(xiàng)

1.由于凍存的細(xì)胞還受其他因素影響，因此可能有部分死亡細(xì)胞，此時(shí)在換液時(shí)可將不貼壁和漂浮在培養(yǎng)液上已死亡的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)充新的培養(yǎng)液；

2.凍存和復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)最好用新配制的培養(yǎng)液；

3.凍存管存取時(shí)一定要做好防護(hù)工作，以免凍傷。