微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員，必須有嚴(yán)格的無菌觀念，許多實(shí)驗(yàn)要求在無菌的條件下進(jìn)行，主要原因，一是防止試驗(yàn)操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個(gè)人污染。要求如下：

1.1  接種細(xì)菌時(shí)必須穿工作服、帶工作帽；

1.2  進(jìn)行接種食品樣品時(shí)，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用；

1.3  接種食品樣品時(shí)，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/p>

1.4  進(jìn)行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用；

1.5  從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及試管或平皿邊；

1.6  接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌活樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

1.7  接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時(shí)還要燒到針和環(huán)與桿的連接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min，再經(jīng)火焰燒灼；

1.8  吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。

二、無菌間使用要求

2.1 無菌間應(yīng)密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及門，另盡量設(shè)有的小窗，以備進(jìn)入無菌間后傳遞物品。

2.2  無菌間應(yīng)保持清潔，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作臺(tái)面，不得存放與試驗(yàn)無關(guān)的物品；

2.3  無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，如采用室內(nèi)懸掉紫外燈消毒時(shí)，需30W紫外燈，距離工作臺(tái)1m處，照射時(shí)間不少于30分鐘，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭，除去上面的灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

2.4  處理和接種食品標(biāo)本時(shí)，進(jìn)入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞；

2.5  在無菌間需用安裝空調(diào)時(shí)，則應(yīng)有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測(cè)用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經(jīng)滅菌后方能使用。

3.1  滅菌前準(zhǔn)備

3.1.1  所有需經(jīng)滅菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將上面氣孔打開。

3.1.2  裝培養(yǎng)基的三角瓶塞好棉塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。

3.2  裝放

3.2.1  大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品不應(yīng)超過鍋內(nèi)容積的80%，物品應(yīng)放置鍋內(nèi)擱架上或鐵絲筐中。

3.2.2  手提式高壓鍋：將物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。

3.3  設(shè)備檢查

3.3.1  檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。

3.3.2  壓力表蒸氣排盡時(shí)是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計(jì)所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。

3.3.3  對(duì)有自動(dòng)電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。

3.4  滅菌處理

手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進(jìn)行：

3.4.1  手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復(fù)使用時(shí)應(yīng)將水量補(bǔ)足，水變混濁需要更換）。

3.4.2  手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。

3.4.3  蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放出冷氣（水沸騰后排氣10～15min）。

3.4.4  關(guān)閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)定要求，并維持規(guī)定時(shí)間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定）。

3.4.5  達(dá)到規(guī)定時(shí)間后，對(duì)需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸汽，待壓力恢復(fù)到零時(shí)，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60℃以下再打開蓋取物，以防止突然減壓液體劇烈沸騰活容器爆破。

3.5 滅菌溫度與時(shí)間

3.5.1壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時(shí)間見下表：

3.5.3  取出的物品掉落在地或誤放不潔之處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用。3.5.2  滅菌處理：滅菌后物品，劑等，應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài)，未達(dá)到者應(yīng)廢棄。

3.5.4  取出的合格滅菌物品，應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。

3.5.5  凡屬合格物品，應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。

3.5.6  每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時(shí)間、操作者。

四、有毒有菌污物處理要求

微生物實(shí)驗(yàn)室所用實(shí)驗(yàn)器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理，一律不得帶出實(shí)驗(yàn)室。

4.1  經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點(diǎn)，待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌。

4.2  經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

4.3  染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小時(shí)，再經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

4.4  涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗(yàn)用的玻片或平皿，必須經(jīng)高壓滅菌后洗滌。

4.5  打碎的培養(yǎng)物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時(shí)后再擦拭干凈。

4.6  污染的工作服或進(jìn)行烈性菌試驗(yàn)所穿的工作服、帽、口罩等，應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。

五、玻璃器皿的清洗要求

5.1 目的  

為了保證微生物實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，必須把器皿徹底清洗干凈。

5.2  注意事項(xiàng)

5.2.1  任何洗滌方法，都不應(yīng)對(duì)玻璃器皿有所損傷，不能用有腐蝕作用的化學(xué)藥劑，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品來擦拭玻璃器皿。

5.2.2  一般新的玻璃器皿用2%的鹽酸液浸泡數(shù)小時(shí)，后用水沖洗干凈。

5.2.3  用過的器皿應(yīng)立即洗滌，放置太久會(huì)增加洗滌困難。

5.2.4  強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及其它氧化物和有揮發(fā)性的有毒物品，都不能倒在洗滌槽內(nèi)，以免污染環(huán)境水質(zhì)，必須倒在廢水缸中。

5.2.5  含有對(duì)人體有傳染性病菌的器具，應(yīng)先煮沸滅菌后再進(jìn)行洗滌。

5.2.6  難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起，以免增加洗滌的麻煩。有油的器皿不要與無油的器皿混在一起，否則使本來無油的器皿沾上了油垢，浪費(fèi)藥劑和時(shí)間。

5.3  洗滌劑的種類：

水、洗衣粉、檸檬洗滌劑、肥皂

5.4  洗滌方法

5.4.1  含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿的洗滌方法：事先應(yīng)將器皿中的瓊脂刮去，然后用清水洗滌，并用試管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰塵和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自來水沖洗。洗好后的器皿應(yīng)倒置晾干或置于干燥箱中干燥至無水滴。

5.4.2  載玻片及蓋玻片的洗滌法：新載玻片及蓋玻片先在20%的鹽酸溶液中浸一小時(shí)，然后用自來水沖洗2~3次，最后用蒸餾水換洗2~3次。用過的載玻片及蓋玻片，應(yīng)用紙擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分鐘后立即用自來水沖洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小時(shí)，再用自來水沖洗至中性。

5.4.3  移液管、倒管的洗滌方法：新的移液管及倒管先在的５％鹽酸溶液中浸一小時(shí)，然后用自來水沖洗幾次，最后用蒸餾水換洗幾次。用過的移液管、倒管先用自來水洗去表面的殘液，再放在洗衣粉水中浸泡一小時(shí)以上，再用自來水沖洗至管內(nèi)壁無殘?jiān)�，最后用蒸餾水換洗次，晾干后入恒溫干燥箱中烘干。

六、培養(yǎng)基、無菌水的制備

6.1  基本原理

培養(yǎng)基的種類很多，不同微生物所需要的培養(yǎng)基不同。培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為液體、固體、半固體三種類型。

6.2  器材

三角瓶、試管、燒杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、鋁箔紙、角匙、杜氏小管、硅膠塞、電爐

6.3  培養(yǎng)基的種類

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(附加抗菌素)、平板計(jì)數(shù)瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白凍肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯、EC肉湯、高鹽察氏瓊脂、三糖鐵瓊脂等

6.4  方法步驟

6.4.1  培養(yǎng)基的制備：

6.4.2  稱量：根據(jù)培養(yǎng)基的配方，稱取適量藥品于搪瓷杯中；

6.4.3  溶解：用量筒量取所需水量，置電爐上加熱，一邊攪拌，至完全溶解，加熱至沸騰，拔掉電源，待冷卻；

6.4.4  分裝：根據(jù)不同需要，立即趁熱分裝入三角瓶或試管中，分裝三角瓶以不超過三角瓶一半為宜，分裝試管一般為管長(zhǎng)的1/5（需根據(jù)試管的大小而定）。液體培養(yǎng)基如乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基約分裝10毫升左右。

6.4.5  塞硅膠塞：裝好培養(yǎng)基的試管應(yīng)塞上硅膠塞，松緊合適，緊貼管壁，不留縫隙，約1/2塞入內(nèi)，這樣即可過濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)。

6.4.6  包裝：三角瓶棉塞頭部應(yīng)用錫箔紙包扎，試管集中于試管簍。

6.5  無菌水的制備：

6.5.1  用10ml移液管量取9.2ml蒸餾水（稀釋水）裝入試管中。

6.5.2  用100ml量筒量取95ml蒸餾水（稀釋水）裝入150ml的三角瓶中�？芍蒙僭S玻璃珠于三角瓶?jī)?nèi)，防止暴沸。

6.5.3  量取240ml蒸餾水（稀釋水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮紙包扎好，高壓滅菌備用。

七、設(shè)備使用原則

7.1  實(shí)驗(yàn)設(shè)備的使用由實(shí)驗(yàn)員嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行，其他人員不得隨意操作。

7.2  實(shí)驗(yàn)設(shè)備的日常維護(hù)保養(yǎng)由實(shí)驗(yàn)員根據(jù)設(shè)備操作說明書進(jìn)行，出現(xiàn)不可排除的故障時(shí)，經(jīng)部門總經(jīng)理批準(zhǔn)，商請(qǐng)專業(yè)人員維修。

7.3  實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行計(jì)量檢測(cè)，確保儀器的準(zhǔn)確性。

7.4  實(shí)驗(yàn)員應(yīng)愛護(hù)儀器設(shè)備，使用前應(yīng)檢查，使用后應(yīng)及時(shí)清理清潔，并定期維護(hù)保養(yǎng)，下班前應(yīng)檢查設(shè)備電源是否關(guān)閉。