（一）樣品的采集

1.采樣目的

確保采集的樣品能代表全部被檢驗的物質(zhì)，使檢驗分析更具代表性。

2.采樣原則

采集的樣品要有代表性，采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調(diào)查，檢查是否有污染源存在，同時能反映全部被檢食品的組成、質(zhì)量和衛(wèi)生狀況。

應(yīng)設(shè)法保持樣品原有微生物狀況，在進行檢驗前不得污染，不發(fā)生變化。

采樣必須遵循無菌操作程，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新潔爾滅、酒精等消毒物滅菌，更不能含有此類消毒藥物，以避免殺掉樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可使用。

3.采樣數(shù)量

取樣數(shù)量的確定，應(yīng)考慮分析項目的要求、分析方法的要求及被檢物的均勻程度三個因素。樣品應(yīng)一式兩份，分別供檢驗、復(fù)檢使用，每份樣品數(shù)量一般不少于200g。

根據(jù)不同種類采樣數(shù)量略有不同，實驗室檢驗樣品一般為25克。

4.采樣方法

采取隨機抽樣的方式。

直接食用的小包裝食品，盡可能取原包裝，直到檢驗前不要開封，以防污染。

如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所采樣品冷卻至0－4℃。

不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細菌增殖。

在將冷凍食品送到實驗室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。

5.樣品的保存和運送

樣品采集完后，應(yīng)迅速送往實驗室檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1－5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在冷凍狀態(tài)下送檢。

冷凍樣品應(yīng)存放在－15℃以下冰箱內(nèi)；冷卻和易腐食品應(yīng)存放在0－5℃冰箱或冷卻庫內(nèi)；其它食品可放在常溫冷暗處。

運送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。

待檢樣品存放時間一般不應(yīng)超過36小時。

 

（二）檢驗樣品的制備

樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。

檢驗冷凍樣品前應(yīng)先使其融化。可在0－4℃融化，時間不超過18小時，也可在溫度不超過45℃的環(huán)境中融化，時間不超過15分鐘。

檢驗液體或半固體樣品前應(yīng)先將其充分搖勻。如容器已裝滿，可迅速翻轉(zhuǎn)25次；如未裝滿，可于7s內(nèi)以30cm的幅度搖動25次。從混樣到檢驗間隔時間不應(yīng)超過3分鐘。

開啟樣品包裝前，先將表面擦干凈，然后用75％乙醇消毒開啟部位及其周圍。

非粘性液體樣品可用吸管吸取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)，吸管插入樣品內(nèi)的深度不應(yīng)超過2.5cm，也不得將吸有樣品的吸管浸入稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)。

粘性液體樣品可用滅菌容器稱取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基。

固體或半固體樣品可用滅菌的均質(zhì)杯稱取一定量，再加適量的稀釋液或培養(yǎng)基進行均質(zhì)，從樣品的均質(zhì)到稀釋和接種，相隔時間不應(yīng)超過15分鐘，或是在無菌生理鹽水里放入玻璃珠，充分振蕩搖勻。

（三）檢驗

實驗室收到樣品后或是自己取樣后，首先進行外觀檢驗，及時按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法進行檢驗，檢驗過程中要認真、負責(zé)，嚴格進行無菌操作，避免環(huán)境中微生物污染。

檢驗所使用的稀釋液、試劑、培養(yǎng)基接觸的一切器皿必須經(jīng)過有效的滅菌。

實驗室所用儀器、設(shè)備的性能應(yīng)定期檢查和校正。

制備試劑和培養(yǎng)基所用的水，應(yīng)為無離子水或用玻璃器皿蒸餾的蒸餾水。

檢驗結(jié)束后，所有帶菌的培養(yǎng)基、試劑、稀釋液和器皿必須盡快滅菌和洗刷。清洗過的器皿不應(yīng)殘留洗滌劑的痕跡。

 

（四）檢驗記錄和結(jié)果的報告

經(jīng)檢驗的每份樣品都應(yīng)有完整的檢驗記錄。樣品檢驗過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗記錄，以作為對結(jié)果分析、判定的依據(jù)，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。

檢驗結(jié)束后，根據(jù)檢驗結(jié)果，及時填寫檢驗報告書，簽字并經(jīng)負責(zé)人審核簽字后發(fā)出。

 

（五）樣品的微生物檢驗流程

 

（六）微生物操作注意要點

無菌操作要求

（1）微生物實驗室工作人員，必須有嚴格的無菌觀念，許多實驗要求在無菌的條件下進行，主要原因，一是防止試驗操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個人污染；

（2）接種細菌時必須穿工作服、帶工作帽；

（3）進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用；

（4）接種食品樣品時，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/span>

（5）進行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用酒精點燃燒灼三次后使用；

（6）從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及試管或平皿邊；

（7）接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌活樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

（8）接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到針和環(huán)與桿的連接處；

（9）吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的吸爾球吸取，不得直接用口吸。 

無菌間使用要求

（1）無菌間應(yīng)密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及門，另盡量設(shè)有小窗，以備進入無菌間后傳遞物品；

（2）無菌間應(yīng)保持清潔，工作后用巴氏消毒溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與試驗無關(guān)的物品；

（3）無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈消毒（30W，1m）時，照射時間不少于30分鐘，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭，除去上面的灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

（4）處理和接種食品樣品時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。

消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經(jīng)滅菌后方能使用。

（1）滅菌前準(zhǔn)備

①所有需經(jīng)滅菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應(yīng)將上面氣孔打開。

裝培養(yǎng)基的三角瓶塞好棉塞，試管蓋好蓋，用紙包好。

（2）裝放

將物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。

（3）設(shè)備檢查

①檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。

②壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，蓋好蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。

③對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。

（4）滅菌處理

手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進行：

①高壓鍋內(nèi)加入清水（重復(fù)使用時應(yīng)將水量補足，水變混濁需要更換）。

②將要滅菌的物品放入滅菌鍋內(nèi)，蓋好蓋子。

接通電源，加熱，水沸騰后打開放氣閥排氣，直到壓力表指針降到0.05Mpa時，關(guān)掉放氣閥。

指針指到121℃時開始計時，達到要求的滅菌時間關(guān)掉開關(guān)，冷卻直到壓力降到0.05Mpa即可通過放氣閥緩慢放氣。

（5）滅菌溫度與時間

①不同類型培養(yǎng)基的滅菌溫度與時間的關(guān)系見下表：

 

②滅菌處理：滅菌后物品，按正常情況已屬無菌，從滅菌器中取出應(yīng)仔細檢查，以免再度污染。

物品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品使用。

取出的物品，如外包裝有明顯的水浸者，不可作為無菌物品使用。

培養(yǎng)基或試劑等，應(yīng)檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài)，未達到者應(yīng)廢棄。

取出的物品掉落在地或誤放不潔之處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用。

取出的合格滅菌物品，應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴禁與未滅菌物品混放。

凡屬合格物品，應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。

每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。

（6）有毒有菌污物處理要求

微生物實驗室所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理，一律不得帶出實驗室。

經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌。

經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小時，再經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗滌。

打碎的培養(yǎng)物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。 

（7）玻璃器皿的清洗要求

①目的  

為了保證微生物實驗順利進行，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，不影響實驗進度，必須把器皿徹底清洗干凈。

②注意事項

任何洗滌方法，都不應(yīng)對玻璃器皿有所損傷，不能用有腐蝕作用的化學(xué)藥劑，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品來擦拭玻璃器皿。

一般新的玻璃器皿用2%的鹽酸液浸泡數(shù)小時，后用水沖洗干凈。

用過的器皿應(yīng)立即洗滌，放置太久會增加洗滌困難。

強酸、強堿及其它氧化物和有揮發(fā)性的有毒物品，都不能倒在洗滌槽內(nèi)，以免污染環(huán)境水質(zhì)，必須倒在廢水缸中。

含有對人體有傳染性病菌的器具，應(yīng)先煮沸滅菌后再進行洗滌。

難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起，以免增加洗滌的麻煩。有油的器皿不要與無油的器皿混在一起，否則使本來無油的器皿沾上了油垢，浪費藥劑和時間。

洗滌劑的種類：水、洗衣粉、檸檬洗滌劑、肥皂。

③洗滌方法

含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿的洗滌方法：事先應(yīng)將器皿中的瓊脂刮去，然后用清水洗滌，并用試管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰塵和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自來水（蒸餾水）沖洗。洗好后的器皿應(yīng)倒置晾干或置于干燥箱中干燥至無水滴。

載玻片及蓋玻片的洗滌法：新載玻片及蓋玻片先在20%的鹽酸溶液中浸一小時，然后用自來水沖洗2~3次，最后用蒸餾水換洗2~3次。用過的載玻片及蓋玻片，應(yīng)用紙擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分鐘后立即用自來水沖洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小時，再用蒸餾水沖洗至中性。

移液管、倒管的洗滌方法：新的移液管及倒管先在的５％鹽酸溶液中浸一小時，然后用自來水沖洗幾次，最后用蒸餾水換洗幾次。用過的移液管、倒管先用自來水洗去表面的殘液，再放在洗衣粉水中浸泡一小時以上，再用自來水沖洗至管內(nèi)壁無殘渣，最后用蒸餾水換洗次，晾干后入恒溫干燥箱中烘干。

（8）培養(yǎng)基、無菌水的制備

①基本原理

培養(yǎng)基的種類很多，不同微生物所需要的培養(yǎng)基不同。培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為液體、固體、半固體三種類型，我們實驗室常用的是固體培養(yǎng)基。

②器材

三角瓶、試管、燒杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、鋁箔紙、藥勺、杜氏小管、硅膠塞（棉塞）、電爐。

培養(yǎng)基的種類

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基等。

方法步驟

培養(yǎng)基的制備：

稱量：根據(jù)培養(yǎng)基的配方，稱取適量藥品于搪瓷杯中。

溶解：用量筒量取所需水量，置電爐上加熱，一邊攪拌，至完全溶解，加熱至沸騰，拔掉電源，待冷卻。

分裝：根據(jù)不同需要，立即趁熱分裝入三角瓶或試管中，分裝三角瓶以不超過三角瓶一半為宜，分裝試管一般為管長的1/5（需根據(jù)試管的大小而定）。液體培養(yǎng)基如乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基約分裝10毫升左右。

塞橡膠（棉）塞：裝好培養(yǎng)基的試管應(yīng)塞上橡膠（棉）塞，松緊合適，緊貼管壁，不留縫隙，約1/2塞入內(nèi)，這樣即可過濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)。

包裝：三角瓶棉塞頭部應(yīng)用錫箔紙包扎，試管集中于試管簍。

無菌水的制備：

用10mL移液管量取9.0mL蒸餾水（稀釋水）裝入試管中。

用250mL量筒量取225mL蒸餾水（稀釋水）裝入250mL的三角瓶中，可置少許玻璃珠于三角瓶內(nèi)，塞上橡膠（棉）塞用牛皮紙包扎好，高壓滅菌備用。 

（9）設(shè)備使用原則

①實驗設(shè)備的使用由實驗員嚴格按照操作說明書進行，其他人員不得隨意操作。

②實驗設(shè)備的日常維護保養(yǎng)由實驗員根據(jù)設(shè)備操作說明書進行，出現(xiàn)不可排除的故障時，經(jīng)部門總經(jīng)理批準(zhǔn)，商請專業(yè)人員維修。

③實驗設(shè)備應(yīng)定期進行計量檢測，確保儀器的準(zhǔn)確性。

④實驗員應(yīng)愛護儀器設(shè)備，使用前應(yīng)檢查，使用后應(yīng)及時清理清潔，并定期維護保養(yǎng)，下班前應(yīng)檢查設(shè)備電源是否關(guān)閉。

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