前 言

 

本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部科技教育司提出。

本標準起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所、農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本標準主要起草人：彭于發(fā)、王錫鋒、李寧、張大兵、羅云波、黃昆侖、汪其懷、賈士榮。

本標準為首次發(fā)布。

 

轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測 通用要求

 

1范圍

 

本標準規(guī)定了轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測的通用要求及轉(zhuǎn)基因植物PCR檢測實驗室的操作規(guī)范。

本標準適用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測。

 

2規(guī)范性引用文件

 

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本適合于本標準。

GB/T15481-2000 檢測和檢驗實驗室能力的通用要求

GB/T6682 分析實驗用水規(guī)格和試驗方法

NY/T673 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測 抽樣

NY/T674 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測 DNA提取和純化

NY/T675 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測 大豆PCR方法

 

3術(shù)語和定義

 

下列術(shù)語和定義適用于本標準。

 

3.1 一般術(shù)語 General terms

3.1.1 轉(zhuǎn)基因生物 genetically modified organism (GMO)

通過基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的生物。包括轉(zhuǎn)基因植物、動物和微生物。

3.1.2 轉(zhuǎn)基因植物 genetically modified plant organism (GMP), transgenic plant

通過基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的植物，是轉(zhuǎn)基因生物的一類。

3.1.3 定性檢測極限 detection limit

以轉(zhuǎn)基因生物（如種子）提取的DNA或標準雙鏈DNA分子作為PCR反應(yīng)的模板，所能檢測到的脫氧核糖核酸（DNA）的極限（需要確保陽性樣品的純度，才能達到本標準檢測方法的靈敏度）。

3.2 與DNA提取和純化相關(guān)的術(shù)語 Terms relative to extraction and purification of DNA

3.2.1 DNA提取 DNA extraction

將DNA從一個樣品的多種組分中分離出來。

3.2.2 DNA純化 DNA purification

獲得不含PCR反應(yīng)抑制因子的DNA。

3.3 與DNA擴增和PCR技術(shù)相關(guān)的術(shù)語 Terms relative to DNA amplification and to the PCR technique

3.3.1 DNA擴增 DNA amplification

體外放大DNA分子拷貝數(shù)的生物學(xué)方法，如PCR。

3.3.2 擴增子 amplicon

由PCR等DNA擴增方法產(chǎn)生的DNA片段。

3.3.3 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）polymerase chain reaction，

模板DNA經(jīng)高溫變性為單鏈，在DNA聚合酶和適宜溫度下，兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上的一段互補序列發(fā)生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四種dNTP （deoxyribonucleoside triphosphate，脫氧核苷三磷酸）為底物，使退火引物延伸從而合成DNA，如此變性、退火和合成DNA反復(fù)循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴增。

3.3.4 引物 primer

一定長度和順序的寡核苷酸鏈。

3.3.5 篩查檢測法 detection by screening

用多種轉(zhuǎn)基因植物共有的標記基因、表達調(diào)控序列等通用元件對被檢產(chǎn)品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分進行PCR檢測的方法。

3.3.6 身份檢測法 detection by identification

與標準品比較確定GMO身份的檢測方法。

3.3.7 靶序列(目的DNA) target sequence (target DNA)

PCR反應(yīng)中檢測特異性擴增的DNA序列。

3.3.8 旁鄰片段 (邊界序列) border fragment (border region, border sequence)

插入在染色體上的外源基因序列和宿主生物基因組片段連接的DNA片段。

3.3.9 終點法分析 endpoint analysis

一種定性、定量的分析方法，如ELISA-PCR，可對PCR反應(yīng)的擴增子進行定性和定量分析。

3.3.10 實時分析 real-time analysis

一種貫串PCR反應(yīng)過程，對PCR擴增效率、擴增情況及數(shù)據(jù)進行監(jiān)控的定量PCR分析方法，如熒光探針的雜交過程的監(jiān)控。

3.3.11 連接片段 junction fragment

兩個不同功能基因序列之間的連接序列或片段。

3.4 與對照相關(guān)的術(shù)語 Terms relative to controls

3.4.1 GMO陽性對照 GMO positive control

用于PCR擴增的標準目的DNA或轉(zhuǎn)基因植物源材料的DNA分子。

3.4.2 GMO陰性對照 GMO negative control

用于PCR擴增的標準非轉(zhuǎn)基因植物材料的DNA分子。

3.4.3 PCR內(nèi)部對照 PCR internal control

加入一種無關(guān)的DNA序列到純化DNA的樣品中，然后再進行PCR擴增，以檢測是否存在PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì)。

3.4.4 陽性PCR對照 positive PCR control

用含有目的序列的樣品DNA進行PCR擴增。

3.4.5 陰性PCR對照 negative PCR control

用不含有目的序列的樣品DNA進行擴增。

3.4.6 PCR空白對照 PCR blank, negative reagent control

以水或不含目的DNA試劑進行PCR反應(yīng)，以驗證PCR反應(yīng)過程中不被污染。

3.4.7 陰性假定對照 negative premise control

在樣品檢測整個操作過程中，敞開PCR反應(yīng)體系，以證明檢測的操作環(huán)境中不含有目的基因片段的污染。

3.4.8 陰性提取對照 negative extraction control

以水作為材料提取DNA，以證明DNA的抽提和制備過程中是否發(fā)生污染。

3.5 與探針相關(guān)的術(shù)語 Terms relative to probes

3.5.1 探針 probe

在引物之間的與目的片段特異性雜交的15—30bp寡核鼓苷酸鏈.

3.5.2 內(nèi)部探針 internal probe

標記的內(nèi)部探針。

3.5.3 內(nèi)標準基因（內(nèi)源參照基因） endogenous reference gene

具有植物物種專一性且拷貝數(shù)恒定、不顯示等位基因變化的保守DNA序列。可用于對基因組中某一目的基因進行定量分析和驗證PCR反應(yīng)體系中是否存在抑制物質(zhì)。

 

4原則

 

轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的定性和定量PCR檢測通常包括四個步驟：

――抽樣

在一批物品中抽取具有代表性的材料，用于檢測分析。

――樣品DNA提取和純化

樣品DNA提取和純化一般包括樣品組織破碎、DNA釋放和DNA從其他化合物中純化等幾個步驟。

――DNA擴增

對目的序列進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。

――結(jié)果分析

對PCR產(chǎn)物進行定性或定量分析，確定試驗樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分或確定轉(zhuǎn)基因成分的含量。

 

5 實驗室通用要求

 

5.1 一般要求

轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測實驗室一般要求按GB/T15481執(zhí)行。

5.2 特殊要求

轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測實驗室分為三個區(qū)：

5.2.1 前PCR區(qū)

前PCR區(qū)專門用于準備各種PCR反應(yīng)體系，此區(qū)域必須保持清潔干凈，而且沒有來自分子克隆和樣品準備的污染源，前PCR區(qū)的試劑、設(shè)備和正壓活塞式移液器必須是專用的。

5.2.2 樣品準備區(qū)

樣品準備區(qū)專門用于樣品的制備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)采取以下預(yù)防措施：

a) PCR產(chǎn)物和帶有要擴增的序列的DNA克隆不在該區(qū)域進行；

b) 檢測的樣品都帶入樣品準備間處理，根據(jù)需要提取DNA；

c) DNA樣品用專門防護或正壓活塞式移液器操作，防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留；

d) 大體積樣品用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。

任何時候都穿實驗服和戴手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在提取DNA過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。

5.2.3 PCR區(qū)

PCR區(qū)專門用于PCR反應(yīng)和反應(yīng)后樣品的處理，該區(qū)使用的所有試劑、一次性器材和儀器都是專用的。由于PCR實驗室所遇到的主要污染源是前一次PCR過程的產(chǎn)物，因此前PCR區(qū)和PCR區(qū)之間試劑和人員不能混雜，實驗室的交通方向是單向的，永遠從“凈區(qū)”到“臟區(qū)”。

 

6 試劑

 

6.1 通用要求

6.1.1 用水應(yīng)符合GB6682中一級水的規(guī)格。

6.1.2 所有化學(xué)試劑如果沒有特別說明，應(yīng)沒有DNA和核酸酶的污染，應(yīng)不含PCR抑制劑。

6.1.3 所有試劑應(yīng)按照shuomingshu要求進行保存。

 

6.2 DNA提取和純化試劑

按NY/T674執(zhí)行。

6.3 DNA擴增試劑

按NY/T675執(zhí)行。

 

7 儀器和設(shè)備

 

通用設(shè)備按GB/T15481-2000執(zhí)行

所有儀器設(shè)備應(yīng)避免植物DNA和核酸酶的污染。

所有儀器設(shè)備，尤其取樣器等與試驗樣品接觸的器具，應(yīng)清潔、不對樣品造成污染。

盛裝樣品的容器或包裝袋應(yīng)為一次性使用的，以避免交叉污染。

 

8 操作程序

 

8.1 通用要求

應(yīng)設(shè)可以檢測或分析下列情況的對照：

――假陽性；

――假陰性；

――存在干擾分析的物質(zhì)；

――分析物質(zhì)降解；

――降低檢測方法的靈敏度；

――降低分析物質(zhì)回收率。

8.2 抽樣

按照NY/T673的方法抽樣。

抽取的樣品應(yīng)具有代表性。

取樣過程中應(yīng)避免樣品散落，防止轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品擴散。

8.3 實驗室樣品和試驗樣品的準備與儲存

樣品的制備方法視樣品的狀態(tài)和特性而定。固態(tài)樣品的制備宜先粉碎至滿足DNA提取的技術(shù)要求，或用液氮研磨至DNA充分釋放并滿足DNA抽提的技術(shù)要求。液態(tài)樣品的制備宜用緩沖液或水充分洗滌，直至其中的DNA完全溶于緩沖液或水中為止。

在接收時應(yīng)注明并記錄樣品重量、生產(chǎn)和包裝條件。

樣品在測試前后應(yīng)放置在密閉的容器內(nèi)，防止交互污染。

樣品應(yīng)在保持組分不發(fā)生變化的條件下儲存。

易腐爛的樣品在分析前應(yīng)根據(jù)需要在4℃、-20℃或-80℃儲存，如有特殊需要應(yīng)在無氧條件下儲存。

應(yīng)記載儲藏條件和時間。

存查樣品應(yīng)妥善保存3個月。檢測為GMO的樣品應(yīng)妥善保存6個月，以備復(fù)驗。保存期滿后，需經(jīng)無害化處理。

8.4 DNA提取和純化

DNA提取和純化按照NY/T674的方法。

8.5 定性PCR檢測

定性PCR檢測按照我國或國際認可的方法。

定性PCR檢測對象包括轉(zhuǎn)基因的目的基因、啟動子、終止子、標記基因等外源基因和元件。檢測時應(yīng)設(shè)陽性對照、陰性對照、試劑空白對照和提取空白對照，同時應(yīng)檢測內(nèi)源基因。

8.6 以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測

以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測按照我國或國際認可的方法。

 

9 通用質(zhì)量保證措施

 

檢測物品的處置按GB/T15481執(zhí)行。

檢測結(jié)果質(zhì)量的保證按GB/T15481-2000中的5.9執(zhí)行。

 

10 結(jié)果分析與表述

10.1 通用要求

檢測結(jié)果不宜表述為分析樣品不含轉(zhuǎn)基因生物。

10.2 結(jié)果分析

10.2.1 通用要求

以下情況認為樣品含有轉(zhuǎn)基因植物DNA：

――擴增片段的特異性通過酶切圖譜、測序、Southern雜交、PCR-ELISA、點雜交或?qū)崟rPCR反應(yīng)進行了驗證。用上述方法該特異性未發(fā)生改變，片段大小也一致，而且與陽性對照相同，不含GMO的非GMO對照不存在任何相似大小的擴增片段。

――所有對照和標準品都顯示正常結(jié)果。

2個平行樣品的檢測結(jié)果應(yīng)一致。出現(xiàn)不一致的，應(yīng)重做2個平行樣品，最終結(jié)果以多數(shù)結(jié)果為準。

10.2.2 定性PCR檢測結(jié)果的表述

10.2.2.1 在模板DNA的量超過被測物種基因組（內(nèi)標準基因）DNA量20000倍的情況下，按下列方式表述結(jié)果：

――對于陰性結(jié)果：“該樣品未檢出×××基因”；

――對于陽性結(jié)果：“該樣品檢出×××基因”。

10.2.2.2 在模板DNA的量低于被測物種基因組（內(nèi)標準基因）DNA量20000倍的情況下，按下列方式表述結(jié)果：

――對于陰性結(jié)果：“該樣品中DNA含量不足，建議對樣品做定量分析以確定所用檢測方法的靈敏度”；

――對于陽性結(jié)果：“該樣品檢出×××基因”。

 

11 檢驗報告

 

檢驗報告應(yīng)包括下列內(nèi)容：

――鑒定樣品所需的所有信息；

――引用的標準和方法，并說明是定性還是定量方法及靈敏度；

――應(yīng)用哪種定量方法（終點法或?qū)崟rPCR）；

――接收樣品和分析樣品的大小；

――樣品的接收日期；

――樣品的分析日期；

――測試樣品的大小；

――檢測結(jié)果；

――測試中觀察到的任何特殊情況；

――對結(jié)果可能產(chǎn)生影響的任何其他異常情況。