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人類免疫缺陷病毒

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2005-11-19
   一、生物學診斷

 。ㄒ唬┬螒B(tài)結(jié)構(gòu)

  病毒呈球形,直徑100~120nm,電鏡下可見一致密的圓錐狀核心,內(nèi)含病毒RNA分子和酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶),病毒外層囊膜系雙層脂質(zhì)蛋白膜,其中嵌有g(shù)p120和gp41,分別組成刺突和跨膜蛋白。囊膜內(nèi)面為P17蛋白構(gòu)成的衣殼,其內(nèi)有核心蛋白(P24)包裹RNA。

 。ǘ┗蚪Y(jié)構(gòu)及編碼蛋白的功能

  HIV基因組長約9.2~9.7kb,含gag、Pol、env、3個結(jié)構(gòu)基因,及至少6個調(diào)控基因(Tat Rev、Nef、Vif、VPU、Vpr)并在基因組的5′端和3′端各含長末端序列(圖30-2)。HIV LTR含順式調(diào)控序列,它們控制前病毒基因的表達。已證明在LTR有啟動子和增強子并含負調(diào)控區(qū)。

  1.gag基因能編碼約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白(P55),經(jīng)蛋白酶水解形成P17,P24核蛋白,使RNA不受外界核酸酶破壞。

  2.Pol基因編碼聚合酶前體蛋白(P34),經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H,均為病毒增殖所必需。

  3.env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160,gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇,已證明HIV中和抗原表位,在gp120 V3環(huán)上,V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū),在病毒與細胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連。gp41與靶細胞融合,促使病毒進入細胞內(nèi)。實驗表明gp41亦有較強抗原性,能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。

  4.TaT 基因編碼蛋白(P14)可與LTR結(jié)合,以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率,也能在轉(zhuǎn)錄后促進病毒mRNA的翻譯。

  5.Rev基因產(chǎn)物是一種順式激活因子,能對env和gag中順式作用抑制序(Cis-Acting repression sequance,Crs) 去抑制作用,增強gag和env基因的表達,以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。

  6.Nef基因編碼蛋白P27對HIV基因的表達有負調(diào)控作用,以推遲病毒復(fù)制。該蛋白作用于HIv cDNA的LTR,抑制整合的病毒轉(zhuǎn)錄?赡苁荋IV在體內(nèi)維持持續(xù)感集體所必需。

  7.Vif基因?qū)IV并非必不可少,但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。

  8.VPU基因為HIV-1所特有,對HIV的有效復(fù)制及病毒體的裝配與成熟不可少。

  9.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物,在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。

  HIV-2基因結(jié)構(gòu)與HIV-1有差別:它不含VPU基因,但有一功能不明VPX基因。核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列,僅40%相同。env基因表達產(chǎn)物激發(fā)機體產(chǎn)生的抗體無交叉反應(yīng)。

 。ㄈ┡囵B(yǎng)特性

  將病人自身外周或骨髓中淋巴細胞經(jīng)PHA刺激48~72小時作體外培養(yǎng)(培養(yǎng)液中加IL2)1~2周后,病毒增殖可釋放至細胞外,并使細胞融合成多核巨細胞,最后細胞破潰死亡。亦可用傳代淋巴細胞系如HT-H9、Molt-4細胞作分離及傳代。

  HIV動物感染范圍窄,僅黑猩猩和長劈猿,一般多用黑猩猩做實驗。用感染HIV細胞或無細胞的HIV濾液感染黑猩猩,或?qū)⒏腥綡IV黑猩猩血液輸給正常黑猩猩都感染成功,邊續(xù)8個月在血液和淋巴液中可持續(xù)分離到HIV,在3~5周后查出HIV特異性抗體,并繼續(xù)維持一定水平。但無論黑猩猩或長臂猿感染后都不發(fā)生疾病。

 。ㄋ模┑挚沽

  HIV對熱敏感。56℃30min滅活,但在室溫保存7天,仍保持活性。不加穩(wěn)定劑病毒-70℃冰凍失去活性,而35%山梨醇或50%胎牛血清中-70℃冰凍3個月仍保持活性。對消毒劑和去污劑亦敏感,0.2%次氯酸鈉0.1%漂白粉,70%乙醇,35%異丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%來蘇爾處理5′能滅活病毒,1%NP-40和0.5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。外紫外線、γ射線有較強抵抗力。

  二、病毒性與免疫性

  (一)傳染源和傳播途徑

  HIV感染者是傳染源,曾從血液、精液、陰道分泌液、眼淚、乳汁等分離得HIV。傳播途徑有:

  1.性傳播:通過男性同性戀之間及異性間的性接觸感染。

  2.血液傳播:通過輸血、血液制品或沒有消毒好的注射器傳播,靜脈嗜毒者共用不經(jīng)消毒的注射器和針頭造成嚴重感染,據(jù)我國云南邊鏡靜脈嗜毒者感染率達60%。

  3.母嬰傳播:包括經(jīng)胎盤、產(chǎn)道和哺乳方式傳播。

 。ǘ┲虏C制

  HIV選擇性地侵犯帶有CD4分子的,主要有T4淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等。細胞表面CD4分子是HIV受體,通過HIV囊膜蛋白gp120與細胞膜上CD4結(jié)合后由gp41介導(dǎo)使毒穿入易感細胞內(nèi),造成細胞破壞。其機制尚未完全清楚,可能通過以下方式起作用:

  1.由于HIV包膜蛋白插入細胞或病毒出芽釋放導(dǎo)致細胞膜通透性增加,產(chǎn)生滲透性溶解。

  2.受染細胞內(nèi)CD-gp120復(fù)合物與細胞器(如高爾基氏體等)的膜融合,使之溶解,導(dǎo)致感染細胞迅速死亡。

  3.HIV感染時未整合的DNA積累,或?qū)毎鞍椎囊种疲瑢?dǎo)致HIV殺傷細胞作用。

  4.HIV感染細胞表達的gp120能與未感染細胞膜上的CD4結(jié)合,在gp41作用下融合形成多核巨細胞而溶解死亡。

  5.HIV感染細胞膜病毒抗原與特異性抗體結(jié)合,通過激活補體或介導(dǎo)ADCC效應(yīng)將細胞裂解。

  6.HIV誘導(dǎo)自身免疫,如gp41與T4細胞膜上MHCⅡ類分子有一同源區(qū),由抗gp41抗體可與這類淋巴細胞起交叉反應(yīng),導(dǎo)致細胞破壞。

  7.細胞程序化死亡(programmed cell death ):在愛滋病發(fā)病時可激活細胞凋亡 (Apoptosis) 。如HIV的gp120與CD4受體結(jié)合;直接激活受感染的細胞凋亡。甚至感染HIV的T細胞表達的囊膜抗原也可啟動正常T細胞,通過細胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起凋亡CD+4細胞的大量破壞,結(jié)果造成以T4細胞缺損為中心的嚴重免疫缺陷,患者主要表現(xiàn):外周淋巴細胞減少,T4/T8比例配置,對植物血凝素和某些抗原的反應(yīng)消失,遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)下降,NK細胞、巨噬細胞活性減弱,IL2、γ干擾素等細胞因子合成減少。病程早期由于B細胞處于多克隆活化狀態(tài),患者血清中l(wèi)g水平往往增高,隨著疾病的進展,B細胞對各種抗原產(chǎn)生抗體的功能也直接和間接地受到影響。

  愛滋病人由于免疫功能嚴重缺損,常合并嚴重的機會感染,常見的有細胞(鳥分枝桿菌)、原蟲(卡氏肺囊蟲、弓形體)、真菌(白色念珠菌、新型隱球菌)、病毒(巨細胞病毒、單純皰疹病毒,乙型肝炎病毒),最后導(dǎo)致無法控制而死亡,另一些病例可發(fā)生Kaposis肉瘤或惡性淋巴瘤。此外,感染單核巨噬細胞中HIV呈低度增殖,不引起病變,但損害其免疫功能,可將病毒傳播全身,引起間質(zhì)肺炎和亞急性腦炎。

  HIV感染人體后,往往經(jīng)歷很長潛伏期(3~5年或更長至8年)才發(fā)病,表明HIV在感染機體中,以潛伏或低水平的慢性感染方式持續(xù)存在。當HIV潛伏細胞受到某些因素刺激,使?jié)摲腍IV激活大量增殖而致病,多數(shù)患者于1-3年內(nèi)為死亡。

 。ㄈ┟庖咝

  HIV感染后可刺激機體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、愛滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體,其中愛滋病病人水平最低,健康同性戀者最高,說明該抗體在體內(nèi)有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內(nèi)存留的病毒接觸,且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異,原有抗體失去作用,使中和抗體不能發(fā)的應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段,HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中,不被免疫系統(tǒng)識別,逃避免疫清除。這些都與HIV引起持續(xù)感染有關(guān)。

  三、微生物學診斷

  檢測HIV感染者體液中病毒抗原和抗體的方法,操作方便,易于普及應(yīng)用,其中抗體檢測尤普通。但HIv P24抗原和病毒基因的測定,在HIV感染檢測中的地位和重要性也日益受到重視。

 。ㄒ唬┛贵w檢測

  主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫熒光試驗(IFA)。ELISA用去污劑裂解HIV或感染細胞液提取物作抗原,IFA用感染細胞涂片作抗原進行抗體檢測,如果發(fā)現(xiàn)陽性標本應(yīng)重復(fù)一次。為防止假陽性,可做Western blot (WB,蛋白印跡法)進一步確證。

  WB法是用聚丙烯酰胺凝膠電泳將HIV蛋白進行分離,再經(jīng)傳移電泳將不同蛋白條帶轉(zhuǎn)移于硝酸纖維膜上,加入病人血清孵育后,用抗人球蛋白酶標抗體染色,就能測出針對不同結(jié)構(gòu)蛋白抗體,如抗gp120、gp41、P24抗體,特異性較高。

  (二)抗原檢測

  用ELISA檢測P24抗原,在HIV感染早期尚未出現(xiàn)抗體時,血中就有該抗原存在.由于P24量太少,陽性率通常較低,F(xiàn)有用解離免疫復(fù)合物法或濃縮P24抗原,來提高敏感性。

 。ㄈ┖怂釞z測

  用PCR法檢測HIV基因,具有快速、高效、敏感和特異等優(yōu)點,目前該法已被應(yīng)用于HIV感染早期診斷及艾滋病的研究中。

 。ㄋ模┎《痉蛛x

  常用方法為共培養(yǎng)法,即用正常人外周血液分離單個核細胞,加PHA刺激并培養(yǎng)后,加入病人單個核細胞診斷及艾滋病的研究中。

 
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