DNA中的鳥嘌呤容易被活性氧自由基羥化成為82羥基鳥嘌呤,這種堿基改變能誘導GCyTA轉(zhuǎn)化,已證實DNA氧化損傷與心血管疾病!老化等慢性病有關(guān)。因此生物體存在預防82羥基鳥嘌呤所致遺傳結(jié)構(gòu)完整性損害的防御機制。
8——羥基鳥嘌呤內(nèi)切酶同時具有82羥基鳥嘌呤糖基酶活性及腺嘌呤核酸內(nèi)切酶活性,該酶分兩步修復DNA中82羥基鳥嘌呤,先將82羥基鳥嘌呤當成自由堿基移去,然后在腺嘌呤位點切開磷酸二酸鍵的3c和5c端。
最近發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌的82羥基鳥嘌呤內(nèi)切酶(糖基酶)能受氧張力增高的誘導,該酶的適應性反應使其在氧化刺激下能發(fā)揮更有效的對抗DNA氧化損傷的作用。至今尚未見有哺乳類組織82羥基鳥嘌呤糖基酶誘導的研究。因此,我們嘗試在大鼠經(jīng)KBrO3處理后,其肝和腎中82羥基鳥嘌呤糖基酶的活性改變。KBrO3是一種選擇性作用于腎臟的氧化性致癌物。在本研究中,僅發(fā)現(xiàn)腎臟82羥基鳥嘌呤糖基酶的活性被氧化誘導,而肝中未被誘導。腎臟中活性增高呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。

1 材料和方法

1.1 寡脫氧核苷酸作為底物用于82羥基鳥嘌呤糖基酶的寡脫氧核苷酸的合成按照Kuchino等描述的方法(1987年)。
1.2 以[14C]82羥基鳥嘌呤作為內(nèi)標物82羥基鳥嘌呤定量的內(nèi)標物[14C]82羥基鳥嘌呤用[14C]鳥嘌呤制備,按照Degan等描述的程序(1991年)。
1.3 以KBrO3作用于動物0.9%KBrO3鹽水通過腹膜內(nèi)注射雄性Fisher大鼠,大鼠體重約120g。給藥前大鼠禁食一夜,為觀察KBrO3作用的時間效應,采用80mgPkg劑量;按
24h時間間隔殺死大鼠。為觀察KBrO3作用的劑量效應,按不同劑量,最高至160mgPkg給藥,給藥后9h殺死,分離其腎和肝來制備組織抽提物。
1.4 組織提取物制備
取出大鼠的腎和肝用0.9%冷鹽水沖去殘血,腎!肝用液氮冷卻貯存于-70e備用,用2倍體積的勻漿緩沖液研磨和勻漿冷凍器官,懸浮的勻漿用
15%的鏈霉素混合,以除去核酸,離心后上清液透析,用作82羥基鳥嘌呤糖基酶分析的組織提取物。上述步驟在4e以下操作。
1.5 酶分析
將4pmol雙鏈DNA底物同5mg上述腎和肝的提取物在30e下孵化2h,1ml反應混合物包括50mmolPLTris2HCl!50mmolPLKCl及1mmolPLEDTA,pH值為7.5,通過90e加熱3min來終止反應,按6000rPmin離心10min,取900Ll上清液加100Ll約400次Pmin14C82羥基鳥嘌呤內(nèi)標液,該混合物加入經(jīng)82羥基鳥嘌呤單克隆抗體制備的免疫親和柱。經(jīng)純化的
82羥基鳥嘌呤溶于50Ll水,注入5Lm,416mm@25cmHPLC柱,進行高效液相色譜!電化學檢測分析,測量電化學檢測器上顯示的82羥基鳥嘌呤峰高及82羥基鳥嘌呤洗提液的放射活性,峰高用于82羥基鳥嘌呤的定量,是反應介質(zhì)和加入14C282羥基鳥嘌呤的總和。從總量中減去內(nèi)標物即得到原反應介質(zhì)中82羥基鳥嘌呤的量。所加14C282羥基鳥嘌呤可通過校準曲線比較其峰高與放射活性來定量。洗提液的放射活性可用來定量在免疫親和柱純化過程中82羥基鳥嘌呤的損失量。加入1ml反應介質(zhì)中的82羥基鳥嘌呤的量可利用損失率和反應介質(zhì)中82羥基鳥嘌呤的原始量來測定,酶活性可表達為在上述反應條件下DNA底物中釋放出來的82羥基鳥嘌呤的含量,數(shù)據(jù)可表達為6次實驗的均值±標準誤。統(tǒng)計分析用t檢驗。

2 結(jié)果

KBrO3對82羥基鳥嘌呤糖基酶活性的影響效應可通過腎與肝中含量的時間及劑量效應來表達。為比較起見,腎臟被選作靶器官,肝臟作控制對比。圖1顯示腹膜內(nèi)給80mgPkg劑量KBrO3后,兩種器官中82羥基鳥嘌呤含量的時間效應關(guān)系,在腎臟,發(fā)現(xiàn)其活性在3h[(0.73±0.14)pmol]時顯著升高,相比之下,在0h活性只有(0.20±0.06)pmol,而在6h時,其活性達到高大值(125±0.14)pmol,該值是0時的6倍。然后,活性開始下降并在12h回到0h水平;作為對比,肝中活性在相同時間段并無顯著變化。圖2顯示其活性與KBrO3劑量的關(guān)系,不加處理時,活性只有(0.20±0.06)pmol,而在20!40!80及
160mgPkgKBrO3腹膜下給予時,其活性分別是(0.33±0.09)!(0.53±0.10)!(0.75±0.13)及(1.30±0.08)pmol,在40mgPkg以上時活性顯著增高,且顯示劑量反應關(guān)系,而肝中活性在相同的劑量范圍內(nèi)并無顯著變化。

3 討論

DNA氧化損傷與心血管疾病!老化等慢性病有關(guān)。本研究顯示哺乳動物82羥基鳥嘌呤糖基酶也能被氧化作用所誘導,KBrO3作用于大鼠后,腎中該酶活性的增高呈現(xiàn)時間與劑量效應關(guān)系(圖.,2),而在肝中則不出現(xiàn)該變化。氧化能被SOD酶!過氧化氫酶等所阻
  
止,也能被氧化修復酶所糾正,如胸腺嘧啶乙二醇糖基酶,82羥基鳥嘌呤修復酶,核酸內(nèi)切酶等,目前關(guān)于氧化修復酶的研究尚少,本研究顯示:82羥基鳥嘌呤糖基酶是可誘導的氧化修復酶。
有證據(jù)顯示需氧生物82羥基鳥嘌呤修復作用的重要性,如DNA中82羥基鳥嘌呤修復酶是普遍存在的,從細菌到哺乳動物的試驗中都能發(fā)現(xiàn)其作用。
DNA中82羥基鳥嘌呤能誘導GCyTA轉(zhuǎn)化,當在12位密碼子上包含82羥基鳥嘌呤的c2Ha2ras基因轉(zhuǎn)染進良性細胞時在該位點誘導GCyTA轉(zhuǎn)化,同時將被轉(zhuǎn)染的良性細胞變成了惡性細胞。
有報道表明,細胞水平的82羥基鳥嘌呤修復活動與致突變作用的誘導與預防有密切關(guān)系。由此可見,82羥基鳥嘌呤的修復,對氧化條件下可能造成的遺傳結(jié)構(gòu)完整性起保護作用。提示82羥基鳥嘌呤糖基酶的誘導能力是保護DNA免遭氧化損傷的有效生理機制。
總之,哺乳動物細胞中82羥基鳥嘌呤糖基酶能被氧化作用所誘導,結(jié)合在大腸埃希菌中已發(fā)現(xiàn)該酶的誘導,說明在所有需氧細胞中82羥基鳥嘌呤糖基酶的適應性反應是一種很普遍的現(xiàn)象。普遍發(fā)現(xiàn)這種適應性反應表明,82羥基鳥嘌呤的修復對于機體在有氧環(huán)境中的生存是一個重要過程。為進一步了解該酶的誘導機制,可研究以下方面問題,如其mRNA水平的改變,弄清誘導啟動信號等。