摘要：本文較為系統地概述了核酸探針檢測技術、利用引物的PCR技術、DNA序列分析技術和電泳分離及顯示技術的研究進展，并探討了這些技術在環境污染研究中的應用及其方向，表明，這些被認為是重要的微生物分子技術，在探索微生物與污染環境之間的相互關系中發揮了重要作用，推進了污染環境微生物研究的發展*
關鍵詞：微生物 分子生物學 環境污染

在新世紀之初，由于全球人增地減、資源匱乏，人類對環境的依賴性愈來愈強烈。隨著人類的生活要求和工農業生產的迅速發展，大量人工合成的并難以被天然微生物迅速降解轉化的污染性化合物進入到自然環境中，成為嚴重威脅人類及其他生物正常生存發展的土壤污染區，污染還導致資源環境中生物重組，使物種的分布與多度均發生深刻的變化，致使系統變得越來越脆弱，降低了生態系統的功能穩定性。因此，治理破壞環境生態的各種污染，已成為世界各國普遍關注并努力攻克的熱點問題。最近20年間，以核酸技術為主要內容的分子生物學技術的廣泛應用，在揭示生物多樣性的研究中提供了新的方法論，開拓了分子生物學與生態學交叉領域。通過檢測生物自然種群DNA序列多態性，鑒定個體的基因型，在基因水平評價種群遺傳分化，并在分子水平闡述分子適應等生態問題的機制，更好地揭示生物與環境之間的生態學意義，為污染環境的生物修復提供理論依據。

1. 微生物分子生態學技術

1.1 核酸探針檢測技術

以核酸分子雜交技術為核心，利用探針分析DNA序列及片段長度多態性*探針是能與特定核苷酸序列發生特異性互補的已知核酸片段，它可以是長探針（100～1000bp），也可以是短核苷酸片段（10～50bp），可以是從RNA制備cDNA探針，也可以是PCR產物或人工合成的寡核苷酸探針。根據堿基互補配對的原則，被標記（放射性或非放射性的）的核苷酸探針以原位雜交、Southern(印跡雜交、斑點印跡和狹線印跡雜交等不同的方法，可直接用來探測溶液中、細胞組織內或固定在膜上的同源核酸序列)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的高度靈敏性，使得核酸分子雜交技術廣泛應用于對環境中的生物的檢測，定性、定量分析它們的存在、分布、豐度和適應性等研究目標。

基因探針方法學利用了DNA能變性和重退火的特性。要做一個基因探針，所研究的這個基因的DNA順序必須清楚。這個基因對一特定的微生物種可能是獨特的，在這種情況下，這一DNA順序就有利于檢出那種微生物體。或者，這個基因可能編碼一種某一代謝途徑獨特的酶，從這樣一種序列構建出的基因探針就有可能指示土壤或水樣品中一群細菌的潛在活性。這類探針可定義為功能性基因探針。例如，由編碼固氮作用的酶的DNA序列可做成基因探針，這樣的探針就可以用于測估特定的土壤中是否含有攜帶固氮基因的細菌。隨后，還可以構建另外的探針，用以測定這些機體實際上是根瘤菌屬或固氮螺菌屬的一些種，或者是藍細菌。這一基因甚至可能對所有的細菌來說是通用的，因而使檢出所有已知細菌成為可能。

1.2 利用引物的PCR技術

在分子生態學中，根據擴增的模板、引物序列來源及反應條件的不同可將PCR技術分為以下幾種：1）反轉錄PCR技術（Rt-PCR），是在mRNA反轉錄之后進行的PCR擴增，可以用來分析不同生長時期的mRNA表達狀況的相關性)。2）競爭PCR（C-PCR），是一種定量PCR，通過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。3）擴增的rDNA限制酶切分析技術（ARDRA），是美國最新發展起來的一項現代生物鑒定技術，它依據原核生物rDNA序列的保守性，將擴增的rDNA片段進行酶切，然后通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性。4）隨機擴增多態性DNA技術（RAPD），是以一個通常為10堿基的寡核苷酸序列為引物，對基因組DNA隨機擴增來鑒別多態性DNA的過程，RAPD分析不需要生物DNA序列，而且DNA用量少，無種族特異性，不需要制備克隆、探針標記和分子雜交等，是一種易推廣應用的技術。

1.3 DNA序列分析

最充分揭示DNA多樣性的方法是DNA序列分析)尤其是熒光標記的核酸自動測序儀的普遍使用，同時隨著分子信息學的發展，已有許多功能基因及專門的’DNA序列數據庫軟件供序列比較，使核基因的序列分析可揭示更高水平多態性)生態學上用的最多的是“通用”引物擴增DNA某些基因（如DNA）的DNA片段，隨后用通用引物直接測序)。

1.4 電泳分離及顯示方法

一般在核酸技術中，都會用到電泳分離方法：瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠染色方法；或聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的方法。相比之下，后者靈敏度高，每次電泳只要加1～3uL的PCR擴增產物，一次擴增可多次電泳，但操作要比瓊脂糖凝膠電泳復雜得多。

1.5 生物芯片

近年來，高通量的DNA序列篩選推動了生物芯片技術的發展。生物芯片是指一套DNA探針，通常是從cDNA或基因組克隆純化的PCR產物，存放在固體支持物（一般用顯微鏡載玻片）上，其密度可達每平方厘米幾百個點。芯片主要用于基因表達。這項技術已經在制藥工業中用于查看藥物反應。然而，這項技術的應用看來是無止境的。在環境微生物學中，生物芯片具有一次試驗就可篩選飲用給水中幾百病原體的潛在能力。

2. 分子生態學技術在環境污染研究中的應用

2.1 污染環境微生物種群動態的分析

在微生物系統分析中，16SrRNA:DNA的比率是檢測復雜的微生物種群特定成員代謝活動的有效參數。核酸可以通過以專一性和通用型探針分別與直接從微生物樣品中分離的總核苷酸進行雜交，可獲得相對于總16SrRNA的特定16SrRNA數量，其相對豐度可以用與專一性探針和通用型探針雜交的殘余放射性強度之比來表示。在穩定的條件下，某種微生物的RNA:DNA比率是與它生長率呈正相關。利用定量點漬雜交求RNA:DNA的比率時，具有很低豐度的rRNA序列也可以被定量，但由于不同種生物細胞內有不同數量的核糖體，甚至同一種細胞內在不同時期核糖體數目也不同，所以rRNA的豐度不能直接用于表示某類微生物細胞數的多少，但可以代表特定種群的相對生理活性，這對研究生態系統功能多樣性有重要的意義。

2.2 污染環境微生物適應性———質粒的分子生態效應

在污染環境中，微生物通過調節其結構和生理狀況，或者形成能在自然環境中廣泛傳播的質粒，完善那些降解異生物質酶系的遺傳基因，以適應日益污染的環境!這種對環境的遺傳適應是進化的機制!探索自然種群對環境的調整與適應的遺傳基礎，特別是微生物對環境污染物的反應，是近代微生物生態學和分子生態學共同關注的焦點!許多研究表明，細菌對環境中的特異性限制因子的應答能力一般是由質粒控制的!質粒在為宿主細胞提供遺傳多樣性及其利用大范圍生態位的適應中起著非常重要的作用。因此，對降解性質粒特征及其在環境污染物凈化或解毒過程的分子生態學進行研究，具有實踐上的重要意義。

質粒為細胞質中進行復制的自主復制子，是染色體外的遺傳物質，核酸技術在分子生態學中的應用成為質粒研究的新動力。質粒的產生不僅會引起種的多樣性，更主要的是它有足夠的靈活遺傳力去發展它們重組質粒所攜帶的代謝基因，表現不同的生態功能，因此，質粒的基因很自然地成為污染環境的微生物分子生態學研究的對象!近年來，已經發現了許多降解脂肪烴、芳香烴、多環芳烴以及它們的氧化產物、萜烯、生物堿、氯代芳烴和多氯聯苯的質粒基因，其中大多來自假單胞菌屬等：微生物分子生態學技術及其在環境污染研究中的應用假單胞菌屬、脫氮產堿桿菌或富營養產堿桿菌、紅球菌的菌株，還有分支桿菌屬的多個種。

3.結語

從污染環境微生物分子生態學的研究進程可見，分子生態學技術的應用不僅擴大了環境微生物的研究對象，促進了微生物結構生態學研究，更重大的突破是有助于更深入、更多地了解生態學過程，使得以功能基因為基礎的功能生態學研究成為今后污染生態學領域的新方向$特別對污染脅迫下的微生物，研究功能基因在環境中的表達調控，可更真實、準確地揭示微生物的生態關系，明確生態系統的結構與功能，即生態系統中一系列基因的相互作用。

在自然界中存在大量可挖掘和利用的具有抗逆性、高降解能力等優異基因的微生物資源，但通過傳統的方法卻不能分離甚至檢測，在分子生態學研究領域可以克服技術上的障礙，檢測更多的微生物種群，并可在分子水平對其生態功能進行分析、操作$目前，很多氯代有機物、多氯聯苯、萘、菲、蒽、芘、菊酯類等污染物的部分降解基因已被克隆并已闡明其序列結構和功能，在此基礎上，可進一步探索自然種群對環境的調整與適應的遺傳基礎，從功能上闡明分子適應及生態學過程的分子機理，進一步通過基因工程操作將某些不同生物體中控制有用的生物降解途徑或酶的微生物異化代謝基因帶到同一寄主中，按照設計的生物代謝途徑運行，以實現對環境污染物或特定毒物的降解，從而顯著地或徹底地改善微生物在污染環境修復中的功能。

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