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乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)方法 杯碟法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-09-01  來源:衛(wèi)生部
核心提示:1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)

本檢測(cè)方法源自:關(guān)于印發(fā)全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案的通知 食品整治辦[2009]29號(hào) ,標(biāo)準(zhǔn)完整內(nèi)容見http://down.foodmate.net/standard/sort/9/22334.html

 

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)的檢驗(yàn)。

本方法的檢出限為4U/mL。

 

2 原理

該方法采用對(duì)青霉素類藥物絕對(duì)敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株,利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性,并加入青霉素作為對(duì)照,通過比對(duì)加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產(chǎn)生的抑制圈的大小來間接測(cè)定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。

 

3 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

3.1 抑菌圈測(cè)量?jī)x或測(cè)量尺。

3.2恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。

3.3 高壓滅菌器。

3.4 無菌培養(yǎng)皿:內(nèi)徑90 mm,底部平整光滑的玻璃皿,具陶瓦蓋。

3.5 無菌牛津杯:外徑(8.00.1) mm,內(nèi)徑(6.00.1) mm,高度(10.00.1) mm。

3.6 麥?zhǔn)媳葷醿x或標(biāo)準(zhǔn)比濁管。

3.7 pH計(jì)。

3.8 無菌吸管:1mL0.01mL刻度值),10mL0.1mL刻度值)。

3.9 加樣器:5μL20μL,20μL -200μL及配套吸頭。

 

4 培養(yǎng)基和試劑 

除另有規(guī)定外,所用試劑均為分析純,水為GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。

4.1 試驗(yàn)菌種:藤黃微球菌(Micrococcus luteus) CMCC(B) 28001傳代次數(shù)不得超過14次。

4.2 磷酸鹽緩沖溶液:按附錄AA.1規(guī)定。

4.3生理鹽水(8.5 g/L):按附錄AA.2規(guī)定。

4.4 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液:按附錄AA.3規(guī)定。

4.5 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液:按附錄AA.4規(guī)定。

4.6 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液按附錄AA.5規(guī)定。。

4.7 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:按附錄AA.6規(guī)定。

4.8 抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ:按附錄AA.7規(guī)定。

 

5.操作步驟

5.1 菌懸液的制備

    將藤黃微球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上,經(jīng)361培養(yǎng)18h-24 h,用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液,測(cè)定菌懸液濃度,終濃度應(yīng)大于1×1010 CFU/mL4 保存,貯存期限2周。

5.2 樣品的制備

將待檢樣品充分混勻,取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管,分別標(biāo)為:A、B、C、D,每個(gè)樣品做三個(gè)平行,共12 管,同時(shí)每次檢驗(yàn)應(yīng)取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對(duì)照。如樣品為乳粉,則將乳粉按1:10的比例稀釋。如樣品為酸性乳制品,應(yīng)調(diào)節(jié)pH值至6-7

5.3 檢驗(yàn)用平板的制備

90mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿,底層加10 mL滅菌的抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108 CFU/mL藤黃微球菌的抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后備用。

5.4  樣品的測(cè)定

按照下列順序分別將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品及純水中:

A 青霉素5 μL。

B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL

C β-內(nèi)酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。

D β-內(nèi)酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL

混勻后,將上述AD 試樣各200 μL 加入放置于檢驗(yàn)用平板上的4個(gè)無菌牛津杯中,361培養(yǎng)培養(yǎng)1822 h ,測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)樣品,取三次平行試驗(yàn)平均值。

5.5 結(jié)果報(bào)告

純水樣品結(jié)果應(yīng)為:(A)、(B)、(D)均應(yīng)產(chǎn)生抑菌圈;(A)的抑菌圈與(B)的抑菌圈相比,差異在3 mm以內(nèi)(3 mm),且重復(fù)性良好;(C)的抑菌圈小于(D)的抑菌圈,差異在3 mm以上(3 mm),且重復(fù)性良好。如為此結(jié)果,則系統(tǒng)成立,可對(duì)樣品結(jié)果進(jìn)行如下判定。

7.1 如果樣品結(jié)果中(B)和、(D)均產(chǎn)生抑菌圈,且(C)與(D)抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm)時(shí),可按7.1.1、7.1.2 判定結(jié)果

7.1.1A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差異在3 mm以上(3 mm),且重復(fù)性良好,應(yīng)判定該試樣添加有β- 內(nèi)酰胺酶,報(bào)告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陽性。

7.1.2A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差異小于3 mm,且重復(fù)性良好,應(yīng)判定該試樣未添加有β- 內(nèi)酰胺酶,報(bào)告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陰性。

7.2 如果(A)和(B)均不產(chǎn)生抑菌圈,應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。


附 錄 A

(規(guī)范性附錄)

培 養(yǎng) 基

A.1 磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0   

     無水磷酸二氫鉀  8.0 g

     無水磷酸氫二鉀  2.0 g

     蒸餾水          加至1000 mL

A.2 生理鹽水(8.5 g/L

     氯化鈉          8.5 g

     蒸餾水          1000 mL

     121高壓滅菌15 min

A.3 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液

    準(zhǔn)確稱取適量青霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為0.1  mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)天配制,當(dāng)天使用。

A.4 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液

    準(zhǔn)確量取或稱取適量β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為16000 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)天配制,當(dāng)天使用。

A.5 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液

    準(zhǔn)確稱取適量舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分裝后-20 保存?zhèn)溆茫豢煞磸?fù)凍融使用。

A.6 營(yíng)養(yǎng)瓊脂

    蛋白胨       10 g

    牛肉膏       3 g

    氯化鈉       5 g

    瓊脂         15-20 g

    蒸餾水       1000 mL

將上述成分加入蒸餾水中,攪混均勻,分裝試管每管約5~8 mL,120高壓滅菌15 min,滅菌后擺放斜面。

A.7 抗生素檢測(cè)培養(yǎng)基Ⅱ

    蛋白胨      10 g

    牛肉浸膏    3 g

    氯化鈉      5 g

    酵母膏      3 g

    葡萄糖      1 g

    瓊脂        14 g

    蒸餾水      1000mL

將上述成分加入蒸餾水中,攪混均勻,120 高壓滅菌15 min其最終pH 值約為6.6。
編輯:foodyy

 
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