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最近，小編在按照標(biāo)準(zhǔn)方法《GB 5009.121-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定 第二法 液相色譜法》做不同的食品基質(zhì)中脫氫乙酸的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)方法中處理果汁、烘焙食品、黃油等樣品的操作流程非常繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、誤差不可控的步驟過多，且回收率不理想。
因此，小編依據(jù)脫氫乙酸的性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行改動(dòng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用P-SAX小柱（強(qiáng)陰離子交換柱）具有“化繁從簡(jiǎn)”的神奇效果，大大提升做樣速度和回收效果~
以下是方法優(yōu)化過程碰到的問題和一些思考分享，以供各位朋友參考交流。
凈化方法的選擇
首先，小編歸納了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的不同基質(zhì)樣品的提取、凈化方法。
果蔬汁、果蔬漿類樣品：
醬菜、發(fā)酵豆制品類樣品：
面包、糕點(diǎn)、焙烤食品餡料、復(fù)合調(diào)味料類樣品：
黃油類樣品：
不難看出，國(guó)標(biāo)的處理方法核心思路為：堿性溶液提取，提取液用甲酸調(diào)節(jié)pH后凈化。部分類型樣品的凈化方法包括液液萃取（LLE）與固相萃取（SPE），如液液萃取法凈化后上機(jī)結(jié)果不理想，則使用C18小柱進(jìn)行固相萃取。
我們都知道，耗時(shí)更短是SPE法相比LLE法的優(yōu)勢(shì)之一，且國(guó)標(biāo)方法中也提及，如果LLE法效果不理想可使用SPE法，說明SPE法凈化效果更有保證。
為了使檢測(cè)方法更加快速高效，小編使用固相萃取法作為凈化方法。
接下來小編將以國(guó)標(biāo)方法12.1.1 為例進(jìn)行方法驗(yàn)證與方法優(yōu)化。
方法驗(yàn)證
為驗(yàn)證國(guó)標(biāo)方法中C18小柱的保留效果，小編先使用脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法驗(yàn)證，確保現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，目標(biāo)化合物使用該方法能被有效回收，才能用來進(jìn)行樣品處理。
參考的國(guó)標(biāo)方法如下：
實(shí)際操作中，小編做了兩個(gè)處理：
1、凈化處理：將脫氫乙酸標(biāo)液按12.1.1步驟凈化，收集洗脫液過濾上機(jī)。
2、未凈化處理：等濃度標(biāo)液作對(duì)照直接上機(jī)檢測(cè)。
來看一下經(jīng)過凈化和未經(jīng)過凈化的樣液脫氫乙酸的回收結(jié)果：
（注：藍(lán)色峰為脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，黑色峰為洗脫液）
不難看出，收集到的洗脫液吸收峰變形嚴(yán)重。
考慮到兩者基質(zhì)溶劑不同，需要考察溶劑對(duì)峰形的影響。
因此小編又取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別用水、70%甲醇溶液配制成濃度為1ppm的上樣溶液，上機(jī)測(cè)定結(jié)果，譜圖如下：
（其中藍(lán)色峰為純水基質(zhì)，黑色峰為70%甲醇基質(zhì)）
由圖可知，直接使用洗脫液上機(jī)會(huì)存在溶劑效應(yīng)，需要將洗脫液中的甲醇除去，因此小編在洗脫步驟之后增加氮吹過程去除甲醇。
令小編沮喪的是，除去甲醇后，回收率仍然不理想（15.35%）。小編收集了上樣、淋洗步驟的流出液上機(jī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物未被檢出。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，導(dǎo)致目標(biāo)物回收率低的情況可能出現(xiàn)在提取環(huán)節(jié)或固相萃取洗脫環(huán)節(jié)，目標(biāo)物可能仍保留在小柱上。
然而，整個(gè)操作過程實(shí)在太繁瑣、太不確定！再去追究哪一步出現(xiàn)問題要花大量時(shí)間！
綜合整個(gè)操作流程，涉及兩個(gè)調(diào)pH步驟，引入的誤差無法準(zhǔn)確控制；樣品提取液較少的時(shí)，繁瑣的操作難免導(dǎo)致目標(biāo)物損失。一方面，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度不好保障，另一方面，繁瑣的流程限制了做樣速度，增加方法改良的時(shí)間成本。這樣的方法即便有效也難實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速處理。
那么換個(gè)思路進(jìn)行方法優(yōu)化如何？
方法優(yōu)化
小編想，既然原有操作復(fù)雜、回收效果也不理想，那么能否通過更換更合適的SPE小柱，實(shí)現(xiàn)對(duì)方法的整體優(yōu)化，達(dá)到準(zhǔn)確，高效的實(shí)驗(yàn)效果？
小柱的選型要由目標(biāo)物性質(zhì)決定，小編首先看了一下脫氫乙酸的化學(xué)性質(zhì)：
脫氫乙酸是吡喃的衍生物，常溫下呈晶體狀。脫氫乙酸晶體難溶于水，在甲醇中溶解度5%（w/w，25℃），水溶液弱酸性，飽和溶液pH=4。其鹽類脫氫乙酸鈉在水中溶解度較大。
脫氫乙酸
脫氫乙酸鈉
這里小編發(fā)現(xiàn)，脫氫乙酸是一種有機(jī)弱酸，其離子化狀態(tài)是弱陰離子。那么，如果能使脫氫乙酸在提取和固相萃取富集環(huán)節(jié)保持離子化狀態(tài)，是否可以利用離子交換機(jī)制選擇小柱呢？
考慮至此，小編選定了月旭P-SAX小柱（強(qiáng)陰離子交換柱）作為SPE凈化柱。使用P-SAX小柱回收脫氫乙酸時(shí)，需要注意兩個(gè)環(huán)節(jié)：
堿性環(huán)境中上樣（脫氫乙酸離子化，被小柱吸附）；
酸性環(huán)境中洗脫（脫氫乙酸變回中性分子，失去與小柱間的作用力，被洗脫）。
優(yōu)化后
在進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化后，最終的實(shí)驗(yàn)步驟、譜圖、回收率如下（以洋蔥基質(zhì)為例）：
▍1、提取：
稱取2g樣品于50mL離心管，加入5mL氫氧化鈉溶液（1mol/L），定容至25mL，渦旋混勻2min，超聲提取15min，8000r/min離心5min，上清液待凈化。
▍2、凈化
SPE柱：月旭Welchrom® P-SAX，規(guī)格：200 mg/6mL。
活化：5mL甲醇，5mL水，棄去
上樣：10ml待凈化液上樣，棄去
淋洗：5mL水，棄去，抽干
洗脫：5mL10%甲酸甲醇，收集于15ml離心管中，抽干
濃縮：40℃氮吹至約200μL，用水定容至2ml，過0.45μm水系濾膜后上HPLC檢測(cè)。
▍3、儀器條件
色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18, 4.6×250mm, 5μm
流動(dòng)相：0.02mol/L乙酸銨（pH=10）：甲醇=35:65
柱溫：35℃
進(jìn)樣量：20μL
檢測(cè)波長(zhǎng)：484nm
流速：1.0mL/min
改進(jìn)后的提取步驟避免了國(guó)標(biāo)方法中兩次調(diào)節(jié)pH的繁瑣，操作快速、回收率更加理想。
小編后來又用黃油、辣條、面包、青團(tuán)等樣品做了驗(yàn)證，回收率和RSD均十分理想。
總結(jié)
在進(jìn)行脫氫乙酸的檢測(cè)中，按方法開發(fā)步驟分別進(jìn)行了洗脫液、SPE小柱類型、前處理方法優(yōu)化。因此在某種目標(biāo)物檢測(cè)方法改進(jìn)時(shí)，需要針對(duì)目標(biāo)物性質(zhì)、SPE機(jī)制、實(shí)驗(yàn)整體流程三個(gè)方面進(jìn)行，且每一個(gè)步驟都需要摸索出最佳條件，從而得出一個(gè)穩(wěn)定、高效的檢測(cè)方法。
文章（文字）來源：網(wǎng)絡(luò)。
因此，小編依據(jù)脫氫乙酸的性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行改動(dòng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用P-SAX小柱（強(qiáng)陰離子交換柱）具有“化繁從簡(jiǎn)”的神奇效果，大大提升做樣速度和回收效果~
以下是方法優(yōu)化過程碰到的問題和一些思考分享，以供各位朋友參考交流。
凈化方法的選擇
首先，小編歸納了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的不同基質(zhì)樣品的提取、凈化方法。
果蔬汁、果蔬漿類樣品：
醬菜、發(fā)酵豆制品類樣品：
面包、糕點(diǎn)、焙烤食品餡料、復(fù)合調(diào)味料類樣品：
黃油類樣品：
不難看出，國(guó)標(biāo)的處理方法核心思路為：堿性溶液提取，提取液用甲酸調(diào)節(jié)pH后凈化。部分類型樣品的凈化方法包括液液萃取（LLE）與固相萃取（SPE），如液液萃取法凈化后上機(jī)結(jié)果不理想，則使用C18小柱進(jìn)行固相萃取。
我們都知道，耗時(shí)更短是SPE法相比LLE法的優(yōu)勢(shì)之一，且國(guó)標(biāo)方法中也提及，如果LLE法效果不理想可使用SPE法，說明SPE法凈化效果更有保證。
為了使檢測(cè)方法更加快速高效，小編使用固相萃取法作為凈化方法。
接下來小編將以國(guó)標(biāo)方法12.1.1 為例進(jìn)行方法驗(yàn)證與方法優(yōu)化。
方法驗(yàn)證
為驗(yàn)證國(guó)標(biāo)方法中C18小柱的保留效果，小編先使用脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法驗(yàn)證，確保現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，目標(biāo)化合物使用該方法能被有效回收，才能用來進(jìn)行樣品處理。
參考的國(guó)標(biāo)方法如下：
實(shí)際操作中，小編做了兩個(gè)處理：
1、凈化處理：將脫氫乙酸標(biāo)液按12.1.1步驟凈化，收集洗脫液過濾上機(jī)。
2、未凈化處理：等濃度標(biāo)液作對(duì)照直接上機(jī)檢測(cè)。
來看一下經(jīng)過凈化和未經(jīng)過凈化的樣液脫氫乙酸的回收結(jié)果：
（注：藍(lán)色峰為脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，黑色峰為洗脫液）
不難看出，收集到的洗脫液吸收峰變形嚴(yán)重。
考慮到兩者基質(zhì)溶劑不同，需要考察溶劑對(duì)峰形的影響。
因此小編又取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別用水、70%甲醇溶液配制成濃度為1ppm的上樣溶液，上機(jī)測(cè)定結(jié)果，譜圖如下：
（其中藍(lán)色峰為純水基質(zhì)，黑色峰為70%甲醇基質(zhì)）
由圖可知，直接使用洗脫液上機(jī)會(huì)存在溶劑效應(yīng)，需要將洗脫液中的甲醇除去，因此小編在洗脫步驟之后增加氮吹過程去除甲醇。
令小編沮喪的是，除去甲醇后，回收率仍然不理想（15.35%）。小編收集了上樣、淋洗步驟的流出液上機(jī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物未被檢出。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，導(dǎo)致目標(biāo)物回收率低的情況可能出現(xiàn)在提取環(huán)節(jié)或固相萃取洗脫環(huán)節(jié)，目標(biāo)物可能仍保留在小柱上。
然而，整個(gè)操作過程實(shí)在太繁瑣、太不確定！再去追究哪一步出現(xiàn)問題要花大量時(shí)間！
綜合整個(gè)操作流程，涉及兩個(gè)調(diào)pH步驟，引入的誤差無法準(zhǔn)確控制；樣品提取液較少的時(shí)，繁瑣的操作難免導(dǎo)致目標(biāo)物損失。一方面，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度不好保障，另一方面，繁瑣的流程限制了做樣速度，增加方法改良的時(shí)間成本。這樣的方法即便有效也難實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速處理。
那么換個(gè)思路進(jìn)行方法優(yōu)化如何？
方法優(yōu)化
小編想，既然原有操作復(fù)雜、回收效果也不理想，那么能否通過更換更合適的SPE小柱，實(shí)現(xiàn)對(duì)方法的整體優(yōu)化，達(dá)到準(zhǔn)確，高效的實(shí)驗(yàn)效果？
小柱的選型要由目標(biāo)物性質(zhì)決定，小編首先看了一下脫氫乙酸的化學(xué)性質(zhì)：
脫氫乙酸是吡喃的衍生物，常溫下呈晶體狀。脫氫乙酸晶體難溶于水，在甲醇中溶解度5%（w/w，25℃），水溶液弱酸性，飽和溶液pH=4。其鹽類脫氫乙酸鈉在水中溶解度較大。
脫氫乙酸
脫氫乙酸鈉
這里小編發(fā)現(xiàn)，脫氫乙酸是一種有機(jī)弱酸，其離子化狀態(tài)是弱陰離子。那么，如果能使脫氫乙酸在提取和固相萃取富集環(huán)節(jié)保持離子化狀態(tài)，是否可以利用離子交換機(jī)制選擇小柱呢？
考慮至此，小編選定了月旭P-SAX小柱（強(qiáng)陰離子交換柱）作為SPE凈化柱。使用P-SAX小柱回收脫氫乙酸時(shí)，需要注意兩個(gè)環(huán)節(jié)：
堿性環(huán)境中上樣（脫氫乙酸離子化，被小柱吸附）；
酸性環(huán)境中洗脫（脫氫乙酸變回中性分子，失去與小柱間的作用力，被洗脫）。
優(yōu)化后
在進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化后，最終的實(shí)驗(yàn)步驟、譜圖、回收率如下（以洋蔥基質(zhì)為例）：
▍1、提取：
稱取2g樣品于50mL離心管，加入5mL氫氧化鈉溶液（1mol/L），定容至25mL，渦旋混勻2min，超聲提取15min，8000r/min離心5min，上清液待凈化。
▍2、凈化
SPE柱：月旭Welchrom® P-SAX，規(guī)格：200 mg/6mL。
活化：5mL甲醇，5mL水，棄去
上樣：10ml待凈化液上樣，棄去
淋洗：5mL水，棄去，抽干
洗脫：5mL10%甲酸甲醇，收集于15ml離心管中，抽干
濃縮：40℃氮吹至約200μL，用水定容至2ml，過0.45μm水系濾膜后上HPLC檢測(cè)。
▍3、儀器條件
色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18, 4.6×250mm, 5μm
流動(dòng)相：0.02mol/L乙酸銨（pH=10）：甲醇=35:65
柱溫：35℃
進(jìn)樣量：20μL
檢測(cè)波長(zhǎng)：484nm
流速：1.0mL/min
改進(jìn)后的提取步驟避免了國(guó)標(biāo)方法中兩次調(diào)節(jié)pH的繁瑣，操作快速、回收率更加理想。
小編后來又用黃油、辣條、面包、青團(tuán)等樣品做了驗(yàn)證，回收率和RSD均十分理想。
總結(jié)
在進(jìn)行脫氫乙酸的檢測(cè)中，按方法開發(fā)步驟分別進(jìn)行了洗脫液、SPE小柱類型、前處理方法優(yōu)化。因此在某種目標(biāo)物檢測(cè)方法改進(jìn)時(shí)，需要針對(duì)目標(biāo)物性質(zhì)、SPE機(jī)制、實(shí)驗(yàn)整體流程三個(gè)方面進(jìn)行，且每一個(gè)步驟都需要摸索出最佳條件，從而得出一個(gè)穩(wěn)定、高效的檢測(cè)方法。
文章（文字）來源：網(wǎng)絡(luò)。
