一、食品中蛋白含量測定的意義

蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。人體內(nèi)酸堿平衡、水平衡的維持，遺傳信息的傳遞、物質(zhì)的代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。人及動(dòng)物只能從食物中得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物來構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)是人體的重要營養(yǎng)物質(zhì)，也是食品中重要營養(yǎng)指標(biāo)。

在各種食品中，蛋白質(zhì)的含量各不相同。測定食品中蛋白含量，對(duì)評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、知道經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。

二、蛋白質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)

  蛋白質(zhì)是由C（碳）、H（氫）、O（氧）、N（氮）組成，一般蛋白質(zhì)可能還會(huì)含有P（磷）、S（硫）、Fe（鐵）、Zn（鋅）、Cu（銅）、B（硼）、Mn(錳)、I（碘）、Mo（鉬）等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳50% ，氫7% ，氧23% ，氮16% ，硫0~3% 及其他微量元素。一切蛋白質(zhì)都含N元素，且各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%。蛋白質(zhì)系數(shù)：任何生物樣品中每1gN的存在，就表示大約有100/16=6.25g蛋白質(zhì)的存在， 6.25常稱為蛋白質(zhì)常數(shù)。
  蛋白質(zhì)是以氨基酸為基本單位構(gòu)成的生物高分子。蛋白質(zhì)分子上氨基酸的序列和由此形成的立體結(jié)構(gòu)構(gòu)成了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性。蛋白質(zhì)具有一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)決定了它的功能。
  氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，蛋白會(huì)約含有20種氨基酸，在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上，將氨基酸分子互相連接成肽鏈。一個(gè)氨基酸分子的氨基和另一個(gè)氨基酸分子的羧基，脫去一分子水而連接起來，這種結(jié)合方式叫做脫水縮合。通過縮合反應(yīng)，在羧基和氨基之間形成的連接兩個(gè)氨基酸分子的那個(gè)鍵叫做肽鍵。由肽鍵連接形成的化合物稱為肽。

三、蛋白質(zhì)的檢測原理

圖2半微量法測蛋白

不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的。

1 消化：

樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物，使有機(jī)物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性溶液中。

2 消化過程中：

在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400℃，加速了整個(gè)反應(yīng)過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會(huì)分解，放出氨而造成損失。

為了加速反應(yīng)過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。

3 蒸餾：

樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

4 吸收與滴定：

蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計(jì)算出總氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。
 
四、步驟

準(zhǔn)確稱取樣品中0.50-2.00g→于500ml凱氏瓶中→加10g無水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通風(fēng)櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續(xù)消化30分鐘→至到樣液呈綠色狀態(tài)，停止消化，冷卻→加200ml水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在凱氏瓶中加波動(dòng)珠數(shù)粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加熱→至凱氏瓶內(nèi)殘液減少到三分之一時(shí)，取出用水沖洗→用0.1N HCl滴定。

五、注意事項(xiàng)

1 樣品應(yīng)是均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)過篩，液體樣要混合均勻。

2 樣品放入凱氏燒瓶時(shí)，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。

3 如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對(duì)于縮短氨化時(shí)間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

4 有機(jī)物分解需要H2SO4量，H2SO4應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g樣品  K2SO4：H2SO4=7g：12ml 這種比例在國內(nèi)外都使用，是公認(rèn)的。

還有一種比例： K2SO4：H2SO4=10 g：20ml

5 消化時(shí)，如不容易呈透明溶液，可將凱氏燒瓶放冷后，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。

6 在整個(gè)消化過程中，不要用強(qiáng)火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

7 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這時(shí)會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時(shí)，要添加硫酸量。

8 消化劑綠色后繼續(xù)消化30分鐘即可

9 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。

10 氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。

11 向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時(shí)Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。

12 蒸餾加NaOH是50%，加的量為H2SO4量的4倍，硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48ml，而且一般高于這個(gè)理論值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強(qiáng)酸，使顏色變紅。

13 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強(qiáng)酸，要求較嚴(yán)，而硼酸是弱酸，在滴定時(shí)，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險(xiǎn)期間一般用4%。