同時分離九種脂溶性維生素及胡蘿卜素，可避免使用多種HPLC方法，并且可減少在對膳食補充劑和營養強化食品中的脂溶性維生素進行定性與定量分析時所需要進行的實驗步驟。快速分離疏水性維生素及胡蘿卜素可顯著提升樣品通量以及減少實驗花費，因而可滿足日益增加的法規依從性需求，以監測大量的分析工作。

沃特世提供的解決方案

配備光電二極管陣列(PDA)檢測器的ACQUITY UPC²™系統

Empower^® 3軟件

ACQUITY UPLC^® HSS C₁₈色譜柱

維生素、胡蘿卜素、脂溶性、維生素A乙酸鹽、維生素A棕櫚酸鹽、維生素D2、α-生育酚、維生素E乙酸鹽、維生素K1、維生素K2、番茄紅素、β-胡蘿卜素、合相色譜分離術、UPC²

引言

脂溶性維生素(FSV)包括維生素A、D、E、K及類胡蘿卜素(例如β-胡蘿卜素)。脂溶性維生素參與許多與重要生理功能相關的復雜代謝反應，例如視力(維生素A)、鈣吸收(維生素D)、細胞膜的抗氧化(維生素E)、及血液凝固(維生素K)。¹β-胡蘿卜素是維生素A的前體，且在人體內具有100%維生素A活性。番茄紅素不是人體的必需營養素，但它的抗氧化性能使它廣受歡迎，越來越多地與其他成分一起被添加到某些膳食補充劑中。幾種脂溶性維生素的化學結構如圖1所示。

 

維生素及營養補充劑是一個價值幾十億的市場。預計在未來的五到十年，這一市場仍將繼續增長。2這是由于全世界的消費者越來越追求更好以及更健康的生活方式，以及越來越注重健康以及飲食習慣。然而，人們也越來越關注從營養補充劑以及營養強化食品中所攝取的脂溶性維生素的安全性問題，特別是維生素A及D，若過量食用，也會帶來嚴重的健康風險。3由于在許多國家，許多針對營養強化食品及膳食補充劑中所添加微量元素的合規性的法律正在擬定或制定中，因此，市場上必然對能夠快速、準確地分析不同產品中的脂溶性維生素含量的分析方法有更高的需求。
 

目前，在進行FSV分離時，最常使用的是液相色譜(LC)方法，反向(RP)與正向(NP)方法均有。^1,3-5雖然有AOAC法可用于對食品及營養補充劑當中的各種脂溶性維生素分別進行定性與定量分析，但卻缺少一種可對維生素預混物中的脂溶性維生素以及類胡蘿卜素同時進行分析的方法。

3由于超高效合相色譜(UPC²™))分離速度快、經濟耐用，因此可考慮將其用于對含有多種脂溶性維生素的藥物制劑進行快速分析。⁶在本應用紀要中，我們闡述了一種單次進樣方法，它可在四分鐘時間內同時分離九種脂溶性維生素。優化后的方法在保留時間以及峰面積方面具有良好的重現性，且可用于進行高通量定量分析。
 

七種脂溶性維生素：視黃醇乙酸鹽(維生素A乙酸鹽)、視黃醇棕櫚酸鹽(維生素A棕櫚酸鹽)、α-生育酚(維生素E)、α-生育酚乙酸鹽(維生素E乙酸鹽)、麥角骨化醇(維生素D2)、維生素K1、維生素K2 (MK-4)；及兩種胡蘿卜素：番茄紅素及β-胡蘿卜素均購自西格瑪公司(Sigma Aldrich)，并且未經處理直接使用。將所有樣品以約0.1 mg/mL的溶解到甲基第三丁基醚(MTBE)中，并轉移到進樣瓶中，準備進行分析。

系統：  配備PDA檢測器的ACQUITY UPC²
流速：  1 mL/min

流動相A：CO₂ 

流動相B：乙腈 

色譜柱： ACQUITY UPLC HSS C18 3.0 x 100 mm，1.8 µm                                              

背壓：   2500 psi 

柱度：   30 °C 

樣品稀釋劑：MTBE 

進樣量：    1µL

樣品瓶：    沃特世玻璃瓶12 x 32 mm螺紋頸瓶，2 mL

PDA掃描范圍：210 - 600 nm 

數據管理：   Empower 3軟件 

梯度：

 

已有大量文獻闡述了利用NPLC及RPLC分離脂溶性維生素以及類胡蘿卜素的方法。^1,3-5由于在分析脂溶性維生素時，通常需要使用低極性有機溶劑來溶解樣本，因此NPLC由于其與有機溶劑的相容性而具有一定優勢，可允許直接進樣脂溶性維生素或脂溶性維生素萃取物，而不需要進行蒸發步驟。RPLC法的色譜分離效率雖然高于NPLC，⁷但由于以下幾點原因，阻礙了其在進行FSV分析上的應用：1)分析物在流動相中溶解度較低，2)對FSV的保留力強，導致運行時間過長。最終，人們選擇使用半水性流動相(甲醇或乙腈與水的混合物)或非水性流動相；后者也稱為非水性反相(NARP) LC。^7-8 UPC²，雖然常作為正相分離技術，但也同樣適用于分離極性較低的分析物。UPC²的主流動相CO2不僅是低極性分析物的良好溶劑(與己烷的極性相近)，也可與在樣品分離過程中用于溶解這些分析物的有機溶劑(例如本研究中所使用的MTBE)相同。此外，CO₂的低極性也可促進分析物與流動相之間的非極性相互作用，從而縮短保留時間和運行時間。

在進行方法開發時，共選用了六種色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3、ACQUITY UPLC HSS C18、ACQUITY UPC² HSS SB、ACQUITY UPC² CSH氟苯基、ACQUITY UPC² 2-乙基吡啶、及ACQUITY UPC² BEH，

以及四種溶劑，包括：異丙醇(IPA)、乙腈(ACN)、乙醇、及IPA/ACN的1：1混合液。只有使用ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱以及ACN的方法才可將非常相似的維生素K1以及K2分離。采用較低的柱溫，30 °C，原因如下：首先，為了提高K1與K2的選擇性；其次，為了最大限度地減少胡蘿卜素在色譜柱上的降解，因為胡蘿卜素非常容易氧化。
 

經方法優化后所得的每種成分的色譜圖以及UV譜分別如圖2及3所示。大體上，九種脂溶性維生素的洗脫順序與它們的LogP值排序相同。利用低乙腈含量(2%)的流動相就可將七種維生素全部洗脫出來，而兩種胡蘿卜素則需要使用含20%乙腈的流動相才可洗脫出來。這一現象，可由分析物的結構以及它們與流動相/固定相之間的相互作用來解釋。在九種分析物中，均存在CO₂與脂溶性維生素親脂性基團之間的非極性相互作用，而七種維生素中的氧原子(呈羰基或羧基的形式)使得分析物與流動相中的乙腈之間產生極性相互作用，這樣就減少了溶離時間。而兩種胡蘿卜素分子不含有雜原子，且分子中的非極性十八烷基碳鏈更容易與固定相形成較強的相互作用，因而其溶離時間更長。


 

為了測試本方法的重現性，將九種脂溶性維生素分別進行六次進樣，如圖4所示。重現性統計數據已概括在表1中。保留時間的相對標準差(RSDs)小于0.25%。在峰面積方面，九種脂溶性維生素中，有七種的RSDs小于1%。第一個峰(維生素A乙酸鹽)的RSD稍大，這是因為隨著進樣次數的增加，基線有所上升。不管怎樣，重現性都應滿足質量監測的要求，其通常要求某一測試方法的重現性公差為±20%。³
 

在本應用紀要中，我們闡述了利用單次進樣UPC²法，在四分鐘內，將九種脂溶性維生素同時分離的方法。經過六次重復進樣得知，九種物質的保留時間的RSD均小于0.25%，峰面積的RSD均小于3%(在大多數情況下<1%)。使用UPC²方法，只需進行一次進樣就可將混合物中的各種脂溶性維生素分析完畢，而不需要像LC法那樣進行多次操作，從而極大地減少了實驗室的工作量。UPC²方法所需時間是傳統分析方法的四分之一至十分之一。由于UPC2分析法分析速度較快，因此適于食品企業/營養補充劑企業等分析量通常較大的法規依從性監測。

1.  Santos J, Mendiola JA, Oliveira MBPP, Ibanez E, Herrero M. Sequential determination of fat- and water-soluble vitamins in green leafy vegetables during storage. J. Chromatogr. A. 2012; 1261:179-188.

2.  http://www.prweb.com/releases/2011/10/prweb8906640.htm

3.  Blake CJ. Status of Methodology for the Determination of Fat-Soluble Vitamins in Foods, Dietary Supplements, and Vitamin Premixes, J. AOAC Inter. 2007; 90(4):897-910.

4.  Gomis DB, Fernandez MP, Gutierrez Alvarez MD. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins and provitamins in milk by microcolumn liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 2000; 891:109-114.

5.  Salo-Vaananen P, Ollilainen V, Mattila P, Lehikoinen K, Salmela-Molsa E, Piironen V. Simultaneous HPLC analysis of fat-soluble vitamins in selected animal products after small-scale extraction, Food Chem. 2000;71:535-543.

6.  Aubin A. Analysis of fat-soluble vitamin capsules using UltraPerformance Convergence Chromatography. Waters Application Note 720004394en.  2012 June.

7.  Nelis HJCF, De Roose J, Vandenbaviere J, De Leenheer AP. Non-aqueous reversed-phase liquid chromatography and fluorimetry compared for determination of retinol in serum. Clin. Chem. 1983; 29(7):1431-1434.

8.  Parris NA. Non-aqueous reversed phase liquid chromatography: a neglected approach to the analysis of low-polarity samples. J Chromatogr. 1978; 157:161-170.