平板劃線
板劃線的操作是為了將菌稀釋從而獲得純培養(yǎng)的單菌落。劃線有多種方式。 

1.三區(qū)平板劃線。

三區(qū)劃線中第一區(qū)所占的區(qū)域大約是平板面積的五分之一到四分之一。第二區(qū)搭過第一區(qū)的面積使微生物數(shù)量得到“稀釋”，第三區(qū)搭過第二區(qū)的面積使微生物數(shù)量進(jìn)一步“稀釋”，第三區(qū)不可與第一區(qū)有重疊的劃線。一般適用于可疑菌落的分離，或可疑菌落的二次平板分離。通常劃完三區(qū)后就可以出現(xiàn)單菌落。三區(qū)劃線如下圖。

2.四區(qū)平板劃線。

四區(qū)平板劃線與上面的三區(qū)劃線類似，只是每一區(qū)的劃線面積相應(yīng)減小，同樣第三區(qū)不可與第一區(qū)相重疊，第四區(qū)不可與第二區(qū)和第一區(qū)相重疊，四區(qū)劃線比三區(qū)劃線多稀釋一次，這樣通過增加劃線區(qū)域，有可能會分離到更多更純的單菌落。

3.單次連續(xù)“之”字平板劃線

其實(shí)在微生物劃線接種中，無論是試管斜面劃線接種還是平板劃線接種，都會用到“之”字劃線。“之”字劃線的要領(lǐng)是：往復(fù)不間斷劃線，但是又不與劃過的路線重復(fù)或重疊。如果菌量比較大，就可以劃得更為密集或者增加一塊平板繼續(xù)“之”字劃線（即連續(xù)劃兩塊板）。“之”字劃線一般適用于分離本身在此培養(yǎng)基上單一且黏性較大的菌類或可疑菌落的純培養(yǎng)。操作如下圖所示。

4.網(wǎng)狀平板劃線

網(wǎng)狀平板花線，其實(shí)就是兩次方向垂直的“之”字劃線重疊在一起，一般用于純培養(yǎng)，目的是通過增加更多的劃線路徑來獲得更多的純培養(yǎng)物，特別是針對一些生長較慢或菌落非常細(xì)小的菌類。

在以上的這些平板劃線的方式中，三區(qū)平板劃線最常用的是分區(qū)劃線法，詳細(xì)操作步驟見下圖。

①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種還環(huán)燒紅。

②在火焰旁冷卻接種換環(huán)，打開試管塞。

③將試管口通過火焰，旋轉(zhuǎn)試管口并小幅度來回移動試管，切不可長時(shí)間讓試管口停滯于火焰上加熱。

④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，挑取一環(huán)菌液。

⑤將試管口通過火焰幾次后，塞上試管塞。將試管放回試管架。

⑥左手拿起培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌液的接種環(huán)迅速深入平皿內(nèi)。從平皿邊緣開始“之”字劃線（基準(zhǔn)線也稱第一區(qū)域），大約劃過平皿的五分之一到四分之一左右的面積。關(guān)閉培養(yǎng)皿蓋，將培養(yǎng)皿調(diào)轉(zhuǎn)大約120°。再次灼燒接種環(huán)，將接種環(huán)在空氣中或靠在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)冷卻后從第一區(qū)域末端開始往第二區(qū)內(nèi)劃線。兩個(gè)區(qū)域劃線的交角大約是120°。重復(fù)以上動作，完成第三區(qū)（甚至第四區(qū)）劃線操作。注意：當(dāng)前操作的劃線只能與相鄰前一區(qū)域相交，絕不能與其他區(qū)域的劃線有重疊。

一般三區(qū)劃線就能分離出單菌落，理想的三區(qū)分區(qū)劃線平板培養(yǎng)后的結(jié)果見下圖。第一區(qū)和第二區(qū)前部的細(xì)菌生長成“直線”，第二區(qū)后部的細(xì)菌生長呈“虛線”。第三區(qū)呈“虛線”和離散的“小點(diǎn)”（即單菌落）。

平板傾注接種的步驟具體操作如圖。

1.先在酒精燈火焰旁打開無菌空平皿，注意開啟幅度不宜過大，加入一定量的樣液。

2.按“倒平板”的步驟加入培養(yǎng)基（注意培養(yǎng)基要水浴保溫在46°左右，溫度太低，培養(yǎng)基容易凝固，溫度太高容易燙傷細(xì)菌）。

3.將平皿蓋上蓋。在桌面劃圓圈滑動，幅度不要太大以免培養(yǎng)基灑漏或?yàn)R到平皿皿蓋。混合均勻后，將平皿置于桌面，待平皿凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿堆疊放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。有時(shí)還會在凝固的培養(yǎng)基表面再倒一層培養(yǎng)基，防止蔓延菌落的出現(xiàn)。

平板涂布是將少量（通常0.2mL~0.5mL）系列稀釋的菌液涂布在預(yù)先傾注好的固體培養(yǎng)基上，靠涂布棒在瓊脂表面均勻鋪開，培養(yǎng)后獲得菌落個(gè)數(shù)的一種計(jì)數(shù)技術(shù)。平板涂布的操作如圖。

1.無菌移取一定量樣液于平皿固體培養(yǎng)基中央。

2.玻璃涂布棒蘸取酒精。注意始終保持涂布棒的涂布一端向下，并且涂布棒上的酒精既要覆蓋全部即將深入平皿的部位又不能滴淌。

3.通過酒精燈火焰點(diǎn)燃。一定注意防止酒精倒流或?yàn)R溢引燃物品或燒到手。

4.左手將皿蓋在酒精燈火焰旁邊打開一個(gè)縫隙，右手將灼燒過的涂布棒涂布一端靠在皿蓋上冷卻。冷卻后將平皿蓋開大一些，用涂布棒刮樣液在培養(yǎng)基表面均勻涂布開。涂布的時(shí)候，涂布棒不能觸碰平皿內(nèi)側(cè)邊緣。如果有條件，涂布過程應(yīng)將平皿置于旋轉(zhuǎn)的涂布臺上。

5.涂布棒再次蘸取酒精，通過火焰點(diǎn)燃滅菌。

6.待平皿表面液體晾干后，翻轉(zhuǎn)平皿，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。