一、稱樣：

（1）一般稱量25g，由于稱樣量較大，標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于稱樣的準(zhǔn)確性未作出明確規(guī)定，微生物室常用稱樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原則，即實(shí)際稱樣時(shí)可根據(jù)樣品情況稱取超出25g（如硬質(zhì)糖果等，檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)樣品實(shí)際情況決定如何稱樣）；

（2）對(duì)于部分食品添加劑已明確須稱取1.0g的，則須嚴(yán)格精確稱量。

二、樣品稀釋：

（1）固體或半固體：稱取25g樣品于均質(zhì)袋中，加入已滅菌的生理鹽水225g，稍捏碎（特別是糕點(diǎn)/面包及其他淀粉制品），放入拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min，此時(shí)即制備成1：10的樣品勻液。以移液器或滅菌吸取該液體至9mL滅菌生理鹽水試管中，換上新的滅菌移液器槍頭，緩緩吸取液體后反復(fù)吹打2次，此時(shí)即制備成1：100的勻液，以此類推，制備10倍系列稀釋勻液。

（2）液體樣品：直接吸取原液進(jìn)行檢驗(yàn)，稀釋時(shí)可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。

三、稀釋度的選�。�

液體樣品可直接取原液進(jìn)行檢驗(yàn)；固體或半固體則必須依據(jù)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選取2-3個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)（一般樣品選取1：10，1：100，1：1000三個(gè)稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)。若遇到不常做的樣品，可適當(dāng)延長稀釋度至1：100000甚至1：1000000）。

四、質(zhì)量控制：

空白對(duì)照：分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對(duì)照。（若空白有菌落生長則該實(shí)驗(yàn)無效）。

五、平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）：

滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

六、有時(shí)樣品基質(zhì)比較特殊，樣品勻液有細(xì)小的顆粒與菌落不易區(qū)分，此時(shí)可采用如下方法進(jìn)行區(qū)分：

（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又稱紅四唑或紅四氮唑，簡(jiǎn)稱TTC），高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為：121℃、20min；

（2）待PCA瓊脂培養(yǎng)基冷卻至適宜傾注溫度時(shí)，無菌加入上述TTC溶液2mL，充分搖勻（此時(shí)PCA中TTC濃度為0.005%）。

加入TTC的目的及注意事項(xiàng)：培養(yǎng)后，菌落被TTC染成紅色，而樣品顆粒不變色，方便計(jì)數(shù)；PCA中TTC的濃度不宜過高，否則會(huì)抑制微生物的生長，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。（特殊情況下方添加TTC，常規(guī)實(shí)驗(yàn)無須添加，特別是對(duì)于菌落數(shù)量較少的樣品不宜添加。方法來源依據(jù)為《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中菌落總數(shù)測(cè)定相關(guān)章節(jié)）

七、稀釋液：

常采用0.85%氯化鈉溶液（生理鹽水），121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。

八、傾注培養(yǎng)基時(shí)，根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)（同一類型樣品的微生物檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)），若樣品有表面蔓延生長的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固后，可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計(jì)數(shù)。

九、水產(chǎn)品30±1℃培養(yǎng)72±3h；其它樣品36±1℃培養(yǎng)48±2h。注意：此處的“水產(chǎn)品”是指生魚片、魷魚干等未經(jīng)深度加工的水產(chǎn)品。

十、本標(biāo)準(zhǔn)的重難點(diǎn)為菌落計(jì)數(shù)及計(jì)算。

除標(biāo)準(zhǔn)中已說明的要求外，有以下幾點(diǎn)需要注意：

（1）菌落計(jì)數(shù)時(shí)，從低稀釋度的平板開始計(jì)數(shù)。若所有平板上的菌落數(shù)均小于30CFU，則須計(jì)數(shù)所有平板上的菌落數(shù)，但僅采用最接近30CFU的兩個(gè)平板的菌落數(shù)來計(jì)算最終菌落總數(shù)。

以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：

（2）當(dāng)?shù)谝幌♂屘荻纫粋�(gè)板上菌落數(shù)高于30，另一個(gè)低于30，則依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)以介于30-300之間的菌落數(shù)作為該稀釋梯度的菌落數(shù)。（存在爭(zhēng)議，實(shí)際遇到該類情況時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待）

以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：

（3）若所有平板上的菌落數(shù)均大于30CFU，則只計(jì)數(shù)30-300CFU之間的平板上的菌落數(shù)，并采用這些數(shù)據(jù)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公式，進(jìn)行最終菌落總數(shù)的計(jì)算，此時(shí)將大于300CFU的記為“多不可計(jì)”，以“TNTC”表示。

以固體樣品舉例，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公示，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：

 （4）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)都大于300，則不能所有都計(jì)為TNTC，必須將最高稀釋度的兩個(gè)平板上的菌落逐一地計(jì)數(shù)，再計(jì)算平均數(shù)，該平均數(shù)為該梯度的菌落總數(shù)，其余平板上的菌落數(shù)可記為TNTC。

以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下：

 （5）計(jì)算菌落總數(shù)時(shí)，須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行計(jì)算。

特殊情況：

①若所有平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)。“最低稀釋倍數(shù)”并不是固定不變的，與檢驗(yàn)人員選取的稀釋度有關(guān)。如：某樣品多次檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)較高，檢驗(yàn)人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上的均無菌落生長，則計(jì)算過程為＜1×1000，最終結(jié)果為＜1000CFU；若選取1:10、1:100、1:1000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，均無菌落生長，則最終結(jié)果為＜10CFU。因此，稀釋度的選擇對(duì)于結(jié)果存在較大影響，選擇時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

②最低稀釋度兩個(gè)平板只有一個(gè)平板上長了1個(gè)菌落，若為固體樣品且本次檢驗(yàn)的最低稀釋倍數(shù)為1:10，此時(shí)計(jì)算過程為（1+0）/2×10=5，由于默認(rèn)固體樣品最小檢出量為10CFU，故本次檢驗(yàn)的菌落總數(shù)結(jié)果為10CFU。注意：對(duì)于該情況一直存在爭(zhēng)議，不同的檢驗(yàn)人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，并無固定做法。（建議檢驗(yàn)人員保持一貫做法，不要隨意更改）

舉例如下：

十一、對(duì)于水產(chǎn)品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數(shù)含量較高、限量值較大的食品類別，建議多增加稀釋梯度（可稀釋至10-4甚至10-5），避免稀釋度較低、濃度較大導(dǎo)致培養(yǎng)后平板上菌落蔓延、彌散而難以計(jì)數(shù)甚至無法計(jì)數(shù)。

GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)

1、7.5%氯化鈉肉湯增菌培養(yǎng)：

（1）若樣品本身在均質(zhì)后清澈，培養(yǎng)18h觀察呈現(xiàn)一定程度的渾濁（與培養(yǎng)前相比），則接種平板；若18h后仍無變化，繼續(xù)培養(yǎng)至24h后無論渾濁與否都接種至平板；

（2）若樣品本身在均質(zhì)后渾濁，則直接培養(yǎng)至24h后再接種平板。

2、血平板：36±1℃培養(yǎng)18h后觀察，若有菌落生長或有菌落生長的跡象（無論是否溶血），則應(yīng)酌情配制NA、BHI并分裝至小試管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、滅菌后NA應(yīng)斜放凝固成瓊脂斜面?zhèn)溆�。至血平板培養(yǎng)至24h取出，挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)挑取菌落接種至NA斜面、BHI肉湯管，36±1℃培養(yǎng)24h。

3、接種原則：

（1）革蘭氏染色后還剩余10個(gè)或10個(gè)以上菌落，則NA、BHI分別接種5管；

（2）若多于5個(gè)（不包括5個(gè)）不足10個(gè)，則BHI接種5管，剩余的接種NA；

（3）5個(gè)及以下則全部接種BHI，不接種NA。

4、BP平板：36±1℃培養(yǎng)24h后觀察，有菌落生長則取出，無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察。若血平板已挑取菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，則不必再挑取BP平板上的菌落進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 若血平板上無菌落生長，則應(yīng)在24h～48h內(nèi)逐步觀察BP平板是否長菌或有無長菌跡象，有則需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落進(jìn)行純化、增菌，36±1℃培養(yǎng)24h。  

5、血漿凝固酶試驗(yàn)：

（1）根據(jù)BHI管數(shù)，取凍干血漿粉，每瓶用移液槍加入0.5mL生理鹽水，使其充分溶解，再換移液槍槍頭取0.3mLBHI培養(yǎng)物加入其中（每管BHI用1個(gè)槍頭），振蕩搖勻后于36±1℃培養(yǎng)，計(jì)時(shí)，每30min觀察一次，如呈現(xiàn)凝固（將試管傾斜或倒置時(shí)出現(xiàn)凝塊）或半凝固（一般的液體呈現(xiàn)凝固）則判定為陽性。若一直不凝固，則一直觀察，直至觀察至6h（查看12次）還未凝固，則試驗(yàn)終止，判定為陰性結(jié)果；若中途出現(xiàn)完全凝固或半凝固，則試驗(yàn)終止，判定為陽性結(jié)果。

（2）同時(shí)取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌懸液后作為陽性對(duì)照、以滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照，分別接種至BHI中同步培養(yǎng)后進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。

（3）若血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果可疑，則挑取NA上的菌落接種BHI再次進(jìn)行試驗(yàn)。

第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法

1、取1mL樣品稀釋勻液接種3個(gè)BP平板（此處并未嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)中0.3mL、0.3mL、0.4mL精確取樣，由于如此操作會(huì)增加試驗(yàn)時(shí)間，無法在15min內(nèi)完成試驗(yàn)）。

2、涂布時(shí)不要觸及平板邊緣（會(huì)導(dǎo)致樣液涂抹不均勻，大部分匯集于邊緣）。

3、可用同一根涂布棒從低稀釋度到高稀釋度進(jìn)行涂布（不用換涂布棒）。

4、涂布完成后應(yīng)稍微放置一段時(shí)間使培養(yǎng)基吸收樣品勻液。

5、若水珠較多，可正置于培養(yǎng)箱中1～2h后再倒置培養(yǎng)。

6、36±1℃培養(yǎng)24h后觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，無典型菌落生長則試驗(yàn)終止。

第三法 金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)法

1、樣品稀釋同菌落總數(shù)，取3個(gè)連續(xù)稀釋度稀釋液（或包括液體樣品原液），每個(gè)稀釋度接種3管7.5%氯化鈉肉湯，每管接種1mL，36±1℃培養(yǎng)18h后觀察，若出現(xiàn)渾濁則接種至BP平板，若無變化則繼續(xù)培養(yǎng)至24h后再接種至BP平板。

2、劃線接種至BP平板，36±1℃培養(yǎng)24h后觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，無典型菌落生長則試驗(yàn)終止。

3、根據(jù)證實(shí)后的陽性管數(shù)差MPN表得出結(jié)果。

GB 4789.4-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)

（標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充）

1、稱取25g樣品于可封口的均質(zhì)袋中，再倒入BPW至250g，盡量排去均質(zhì)袋中的空氣后再封口、均質(zhì)后直接置于36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（標(biāo)準(zhǔn)要求為8～18h，一般培養(yǎng)過夜后第二天早晨繼續(xù)下一步試驗(yàn)）

2、TTB、SC應(yīng)酌情配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。若BPW放入培養(yǎng)箱的當(dāng)日時(shí)間允許，則可將TTB、SC滅菌、配制、分裝后冷藏以備第二天實(shí)驗(yàn)；若當(dāng)日時(shí)間不允許，則次日早晨滅菌、分裝，下午即可轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。

3、TTB：滅菌條件為121℃15min，與一般試驗(yàn)耗材、培養(yǎng)基的滅菌條件一致，故在滅菌時(shí)可考慮同時(shí)滅為一鍋。且須同時(shí)滅一些帶塞（可帶塑料蓋子）的小試管、10mL移液槍槍頭、1mL移液槍槍頭，在滅菌完成后溫度降至不燙手時(shí)，輕輕晃動(dòng)三角燒瓶使底部白色沉淀物浮起而充分混勻，每100mLTTB中加入1支碘液（陸橋，P-72）、1支0.1%煌綠（陸橋，P-73），充分搖勻至整瓶TTB呈現(xiàn)綠色，此時(shí)用移液槍準(zhǔn)確吸取10mLTTB至已滅菌的小試管中，蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中，于42℃培養(yǎng)18～24h（若時(shí)間允許、或18h后觀察試管仍無渾濁，則培養(yǎng)至24h，否則培養(yǎng)至18h即可）。

4、SC：僅需加熱煮沸滅菌（因SC易溶于水，煮沸即可，無需過度加熱），冷卻至不燙手時(shí)用移液槍吸取10mL分裝至已滅菌的小試管中，蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管SC中，于36±1℃培養(yǎng)18～24h（若時(shí)間允許、或18h后觀察試管仍無渾濁，則培養(yǎng)至24h，否則培養(yǎng)至18h即可）。

5、BS、XLD應(yīng)酌情配制，在用前一天配制后備用（兩者僅需加熱滅菌、不添加任何添加劑，無需過度加熱）。BS在不燙手時(shí)即可倒成平板，否則容易沉淀或凝固，且在倒平板前應(yīng)充分搖勻以防止有效成分沉淀于底部（棕色或棕黃色顆粒物）。XLD過度加熱會(huì)造成瓊脂不易凝固、劃線時(shí)容易劃破，甚至不凝結(jié)成塊、無法倒置。

6、XLD培養(yǎng)條件：36±1℃培養(yǎng)18～24h。18h后觀察，若TTB、SC增菌液都有菌落生長，則可挑取任意生長良好的菌落進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)；若只有其中一種增菌液有菌落生長、或兩者都無菌落生長，則繼續(xù)培養(yǎng)至24h再觀察，此時(shí)無論菌落生長與否都不再繼續(xù)培養(yǎng)，只要其中任一增菌液有典型或可疑沙門氏菌生長則挑取進(jìn)行生化試驗(yàn)。

7、生化鑒定：

（1）一般情況下，XLD上的任一增菌液長菌，則BS上對(duì)應(yīng)增菌液也會(huì)長菌，此時(shí)若已挑取XLD上的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，則無需挑取BS上的菌落；或XLD上的兩種增菌液長了形態(tài)特征完全相同的菌落，則挑取任一典型菌落進(jìn)行生化鑒定即可，且無論BS上菌落生長如何，都不再挑取BS上的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)。

（2）若出現(xiàn)XLD未長菌的增菌液在BS上長菌，則還需挑取BS上的該菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)。

（3）用生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定，依據(jù)產(chǎn)品說明書判斷陰性或陽性，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中表2～表5的內(nèi)容逐步進(jìn)行判定（即生化鑒定試劑盒是將標(biāo)準(zhǔn)中的所有鑒定步驟同時(shí)完成，但判定時(shí)依然要按照標(biāo)準(zhǔn)逐步判定，只要其中任一階段可判定為非沙門氏菌屬，則不再往下判定，鑒定試驗(yàn)即終止）

（4）若判定為沙門氏菌屬，則可選擇進(jìn)行或不進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。首先應(yīng)確定該菌落無自凝性，否則無法進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。