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16、 PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。
17 、Western Blot內參選擇什么合適？
答：這與目標抗原的表達位置有關，對于胞漿和全細胞蛋白，可選擇內參β-actin、GAPDH和Tubulin；線粒體蛋白則可選擇內參VCDA1/Porin和COXIV；核內抗原可以選擇內參Lamin B1、TBP和histone。
18、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上，轉移效率低？
答：轉移緩沖液中加入20% 甲醇（終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉移效率；使用戊er醛交聯；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉膜電壓/電流，增加轉移時間。
19、轉膜時凝膠腫脹或卷曲？
答：可將凝膠在轉膜前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10min。
20、跑膠的條帶歪斜或者漂移？
答：電轉儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。
21、轉膜后膜上有單個或多個白點？
答：轉膜時確保膜和膠塊之間沒有氣泡。
22、轉膜緩沖液過熱？
答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過高，轉膜過程中注意降溫。
23、顯影后膠片背景太高？
答：轉膜前PVDF膜沒有用100%甲醇全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數；封閉不全，選擇合適的封閉液和提高封閉時間；二抗濃度過高，降低二抗濃度；一抗特異性不強，換用特異性較強的單克隆抗體；曝光時間過長，減少曝光時間。
24、結果沒有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？
答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設置已知標準量蛋白的對照；抗體稀釋比例太低，孵育時間不夠；轉膜不好，轉膜后可先用麗春紅染色觀看染色效果；曝光時間過短，增加曝光時間；抗體保存不當，效價降低。
25、目的條帶位置偏低或者偏高？
答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。
26、有非特異性條帶？
答：目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙�；稽c等），本身可以呈現多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特異性引起的結果，可設立一組不加一抗只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異性結合；樣品蛋白質可能降解，提取蛋白時注意冰上操作，加入適當的蛋白酶抑制劑，避免樣品反復凍融；抗體濃度過高，降低一抗和二抗的濃度。
27、膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。二抗的HRP活性太強，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩定，失活；ECL底物沒覆蓋到相應位置；二抗失活。
28、目的條帶是白色，周圍有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗濃度偏高，二抗上HRP催化活力太強。
答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。
17 、Western Blot內參選擇什么合適？
答：這與目標抗原的表達位置有關，對于胞漿和全細胞蛋白，可選擇內參β-actin、GAPDH和Tubulin；線粒體蛋白則可選擇內參VCDA1/Porin和COXIV；核內抗原可以選擇內參Lamin B1、TBP和histone。
18、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上，轉移效率低？
答：轉移緩沖液中加入20% 甲醇（終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉移效率；使用戊er醛交聯；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉膜電壓/電流，增加轉移時間。
19、轉膜時凝膠腫脹或卷曲？
答：可將凝膠在轉膜前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10min。
20、跑膠的條帶歪斜或者漂移？
答：電轉儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。
21、轉膜后膜上有單個或多個白點？
答：轉膜時確保膜和膠塊之間沒有氣泡。
22、轉膜緩沖液過熱？
答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過高，轉膜過程中注意降溫。
23、顯影后膠片背景太高？
答：轉膜前PVDF膜沒有用100%甲醇全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數；封閉不全，選擇合適的封閉液和提高封閉時間；二抗濃度過高，降低二抗濃度；一抗特異性不強，換用特異性較強的單克隆抗體；曝光時間過長，減少曝光時間。
24、結果沒有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？
答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設置已知標準量蛋白的對照；抗體稀釋比例太低，孵育時間不夠；轉膜不好，轉膜后可先用麗春紅染色觀看染色效果；曝光時間過短，增加曝光時間；抗體保存不當，效價降低。
25、目的條帶位置偏低或者偏高？
答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。
26、有非特異性條帶？
答：目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙�；稽c等），本身可以呈現多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特異性引起的結果，可設立一組不加一抗只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異性結合；樣品蛋白質可能降解，提取蛋白時注意冰上操作，加入適當的蛋白酶抑制劑，避免樣品反復凍融；抗體濃度過高，降低一抗和二抗的濃度。
27、膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。二抗的HRP活性太強，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩定，失活；ECL底物沒覆蓋到相應位置；二抗失活。
28、目的條帶是白色，周圍有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗濃度偏高，二抗上HRP催化活力太強。
