一、反相色譜柱的選擇

1.柱子的PH值使用范圍

反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動(dòng)相的PH值小于2時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鍵合相的水解；當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會(huì)塌陷。同樣填料各種不同牌號(hào)的色譜柱不盡相同。如果流動(dòng)相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時(shí)，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。

2.填料的端基封尾（或稱封口）

把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾，可改善對(duì)極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。

二、液相色譜柱的使用

色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。

1.樣品的前處理

a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。

b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不 可逆吸附的雜質(zhì)。

c、使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。

2.流動(dòng)相的配制

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。

b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)

c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。 

f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3.流動(dòng)相流速的選擇

因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

a．含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖 溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

b．流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。

c．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

三．色譜柱的維護(hù)

1.色譜柱的平衡 

反相色譜柱由工廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來(lái)平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問(wèn)題方面獲得最大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長(zhǎng)！操作步驟：

a. 平衡開(kāi)始時(shí)將流速緩慢地提高，用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑流速如果較低，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡）

b. 如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過(guò)渡"即每天分析開(kāi)始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡； 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。

2.色譜柱的再生

長(zhǎng)期使用的色譜柱，往往柱效會(huì)下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）。可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。　

建議用來(lái)沖洗柱子的溶劑體積

色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積

125-4mm 1.6ml 30ml

250-4 mm 3.2ml 60ml 

250-10mm 20ml 400ml 

選擇再生方法：

極性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色譜填料）的再生：

正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

非極性固定相（如反相色譜填料RP－18，RP－8，CN等）的再生： 水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水

注意：

a. 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。 

b. 0.05M稀硫酸可以用來(lái)清洗已污染的色譜柱，如果簡(jiǎn)單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

3.色譜柱的維護(hù) 

a．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）

b．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍

c．避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化

d．流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理

e．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中

f．氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。