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分光光度計(jì)是利用物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收的特性，以較純的單色光作為入射光，測(cè)定物質(zhì)對(duì)光的吸收，從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的儀器。在使用過(guò)程中常常會(huì)出現(xiàn)測(cè)量誤差，這些誤差又是如何產(chǎn)生的呢？
儀器本身性能帶來(lái)的誤差
1 復(fù)色光對(duì)比耳定律的偏離比耳定律成立的前提條件是入射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計(jì)，也只能獲得近乎單色的光，無(wú)法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復(fù)色光的性質(zhì)。而復(fù)色光會(huì)導(dǎo)致比耳定律的正或負(fù)偏離。固定狹縫的紫外分光光度計(jì)光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調(diào)狹縫的可以做到0.1nm；可見(jiàn)分光光度計(jì)帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。光譜帶寬應(yīng)該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時(shí)要綜合考慮各種條件的影響。當(dāng)溶液濃度較小且單色光較純時(shí)，可近似認(rèn)為符合比耳定律。
2 雜散光的影響雜散光是指進(jìn)入檢測(cè)器的處于待測(cè)波長(zhǎng)光譜帶寬范圍外的其他波長(zhǎng)組分，它是光譜測(cè)量中誤差的主要來(lái)源。產(chǎn)生原因有：分光光度計(jì)的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計(jì)工作波段邊緣波長(zhǎng)處，由于單色器透光率、光源輻射強(qiáng)度、檢測(cè)器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴(yán)重的測(cè)量誤差，實(shí)際工作中，在定量分析時(shí)，一般在吸收峰或其附近處測(cè)量樣品吸光度，如果在分析波長(zhǎng)處含有雜散光，這時(shí)樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過(guò)，使測(cè)量吸光度低于真實(shí)吸光度。
3 儀器噪聲對(duì)測(cè)t的影響儀器噪聲也是儀器的一個(gè)重要指標(biāo)，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測(cè)量的分析信號(hào)中的不需要的信號(hào)，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計(jì)的絕對(duì)噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會(huì)掩蓋較小的測(cè)量信號(hào)，一般用噪音的二倍來(lái)表示儀器的靈敏度。
4 波長(zhǎng)和吸光度準(zhǔn)確度樣品的每一個(gè)值都是在一定的波長(zhǎng)下測(cè)得的，如果波長(zhǎng)誤差很大，測(cè)出的值肯定不準(zhǔn)。吸光度準(zhǔn)確度也是用戶對(duì)儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)透射比準(zhǔn)確度為A級(jí)±0.6%， B級(jí)±1.0%。
測(cè)量條件的選擇
1 參比溶液和溶劑的選擇分光光度計(jì)的測(cè)量實(shí)際上是以通過(guò)參比池的光強(qiáng)度作為入射光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定試樣的吸光度，先調(diào)節(jié)儀器使透過(guò)參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過(guò)樣品，使得吸光度比較真實(shí)地反映待測(cè)物質(zhì)的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測(cè)物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測(cè)定波長(zhǎng)下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應(yīng)一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對(duì)測(cè)定有干擾，而所用顯色劑沒(méi)顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。正確選擇合適的溶劑，對(duì)提高分析的準(zhǔn)確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響，應(yīng)選擇高純度的溶劑；溶劑應(yīng)不與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；待測(cè)物在溶劑中要有一定的溶解度；在測(cè)定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，溶劑本身沒(méi)有吸收，注意常用溶劑的最短可用波長(zhǎng)；當(dāng)用揮發(fā)性大的溶劑時(shí)，測(cè)量過(guò)程中吸收池應(yīng)加蓋。
2 測(cè)試波長(zhǎng)的選擇當(dāng)用分光光度計(jì)對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)，首先需要選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)。選擇的依據(jù)是該被測(cè)溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)量波長(zhǎng)，這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過(guò)大或附近有干擾存在，就不能選最大吸收波長(zhǎng)，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定(曲線較平坦處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng))，以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長(zhǎng)的有效手段和方法。
儀器本身性能帶來(lái)的誤差
1 復(fù)色光對(duì)比耳定律的偏離比耳定律成立的前提條件是入射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計(jì)，也只能獲得近乎單色的光，無(wú)法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復(fù)色光的性質(zhì)。而復(fù)色光會(huì)導(dǎo)致比耳定律的正或負(fù)偏離。固定狹縫的紫外分光光度計(jì)光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調(diào)狹縫的可以做到0.1nm；可見(jiàn)分光光度計(jì)帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。光譜帶寬應(yīng)該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時(shí)要綜合考慮各種條件的影響。當(dāng)溶液濃度較小且單色光較純時(shí)，可近似認(rèn)為符合比耳定律。
2 雜散光的影響雜散光是指進(jìn)入檢測(cè)器的處于待測(cè)波長(zhǎng)光譜帶寬范圍外的其他波長(zhǎng)組分，它是光譜測(cè)量中誤差的主要來(lái)源。產(chǎn)生原因有：分光光度計(jì)的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計(jì)工作波段邊緣波長(zhǎng)處，由于單色器透光率、光源輻射強(qiáng)度、檢測(cè)器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴(yán)重的測(cè)量誤差，實(shí)際工作中，在定量分析時(shí)，一般在吸收峰或其附近處測(cè)量樣品吸光度，如果在分析波長(zhǎng)處含有雜散光，這時(shí)樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過(guò)，使測(cè)量吸光度低于真實(shí)吸光度。
3 儀器噪聲對(duì)測(cè)t的影響儀器噪聲也是儀器的一個(gè)重要指標(biāo)，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測(cè)量的分析信號(hào)中的不需要的信號(hào)，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計(jì)的絕對(duì)噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會(huì)掩蓋較小的測(cè)量信號(hào)，一般用噪音的二倍來(lái)表示儀器的靈敏度。
4 波長(zhǎng)和吸光度準(zhǔn)確度樣品的每一個(gè)值都是在一定的波長(zhǎng)下測(cè)得的，如果波長(zhǎng)誤差很大，測(cè)出的值肯定不準(zhǔn)。吸光度準(zhǔn)確度也是用戶對(duì)儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)透射比準(zhǔn)確度為A級(jí)±0.6%， B級(jí)±1.0%。
測(cè)量條件的選擇
1 參比溶液和溶劑的選擇分光光度計(jì)的測(cè)量實(shí)際上是以通過(guò)參比池的光強(qiáng)度作為入射光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定試樣的吸光度，先調(diào)節(jié)儀器使透過(guò)參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過(guò)樣品，使得吸光度比較真實(shí)地反映待測(cè)物質(zhì)的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測(cè)物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測(cè)定波長(zhǎng)下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應(yīng)一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對(duì)測(cè)定有干擾，而所用顯色劑沒(méi)顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。正確選擇合適的溶劑，對(duì)提高分析的準(zhǔn)確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響，應(yīng)選擇高純度的溶劑；溶劑應(yīng)不與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；待測(cè)物在溶劑中要有一定的溶解度；在測(cè)定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，溶劑本身沒(méi)有吸收，注意常用溶劑的最短可用波長(zhǎng)；當(dāng)用揮發(fā)性大的溶劑時(shí)，測(cè)量過(guò)程中吸收池應(yīng)加蓋。
2 測(cè)試波長(zhǎng)的選擇當(dāng)用分光光度計(jì)對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)，首先需要選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)。選擇的依據(jù)是該被測(cè)溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)量波長(zhǎng)，這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過(guò)大或附近有干擾存在，就不能選最大吸收波長(zhǎng)，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定(曲線較平坦處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng))，以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長(zhǎng)的有效手段和方法。
