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IgM分子由5個亞基組成，亞基之間有二硫鍵（S-S）鏈接，二硫鍵同時還連接著亞基中重鏈和輕鏈。亞基之間的二硫鍵能被硫醇試劑裂解，但是亞基內(nèi)連接重鏈和輕鏈的二硫鍵不容易被硫醇裂解。同樣IgA單體和IgG重鏈和輕鍵間的二硫鍵也不容易被硫醇試劑裂解。巰基試劑能裂解IgM型抗體，使其成為IgM亞基單體，而不會造成IgG抗體的減少。輸血科常用試劑有二硫蘇糖醇（DTT）和2-巰基乙醇（2-Me）。
適用場景一
產(chǎn)前檢查同種免疫抗體引起的HDFN的可能性。
1、定義：胎兒新生兒溶血病(HDFN)是指因胎母血型不合，通過胎母輸血，母體針對與其不同的胎兒紅細胞血型抗原產(chǎn)生相應(yīng)抗體經(jīng)胎盤進入胎兒血液循環(huán)，導(dǎo)致胎兒或新生兒同種免疫性溶血引起的一系列臨床癥狀。
2、適用范圍：Rh及ABO血型系統(tǒng)血型不合引起的溶血病最常見。其他血型系統(tǒng)，如MNSs、Kell、Kidd、Duffy、Lewis、Diego等血型系統(tǒng)也可導(dǎo)致新生兒溶血病。而ABO-HDFN和抗-M-HDFN目前較常見的、可發(fā)生第一胎，母體常常存在IgM+IgG的抗-A/B、抗-M，進行母體血抗體效價檢測時，需要使用巰基試劑滅活I(lǐng)gM抗體活性，以便檢測共存的IgG抗體。
3、操作步驟：
3.1 0.2M的2-Me或0.01mol/L DTT與受檢母體血清在試管內(nèi)等量混合，加塞置室溫30分鐘（或37℃ 10分鐘）
3.2 處理后血清用鹽水倍量稀釋，每管50μl，稀釋到第10管
3.3 每管加相應(yīng)3%（A/B/MN）紅細胞鹽水懸液50μl，以3400轉(zhuǎn)／分1000g離心后15秒后，肉眼觀察，記錄鹽水介質(zhì)凝集效價
3.4 37℃孵育30分鐘，三洗，用抗人球法檢測IgG抗體效價
4、結(jié)果判定：當抗球蛋白介質(zhì)凝集效價大于等于鹽水介質(zhì)凝集效價二管（4倍）時，可以認為抗球蛋白介質(zhì)凝集效價即為IgG抗體效價。
注意事項：由于開始血清已被2-Me稀釋1倍，因此倍比稀釋的第一管時為4倍稀釋。
適用場景二
解離IgM抗體引起的自身凝集[1]
1、原理：巰基試劑可以裂解將單體亞單位連接成五聚體IgM分子的二硫鍵，這種五聚體分子可以呈冷凝集自身抗體性質(zhì)，與自身紅細胞的反應(yīng)發(fā)生凝集。巰基試劑可以消除紅細胞的自發(fā)凝集，為血型提供不凝集的標本。
2、適用范圍：本方法常用于IgM抗體致敏的紅細胞干擾ABO血型正定型。
3、操作步驟：
3.1 用生理鹽水稀釋紅細胞濃度為50%。
3.2 在紅細胞中加入等量的0.01mol/L DTT或0.1mol/L 2-ME。
3.3 37℃孵育10min(2-ME)或15min(DTT)。
3.4 用生理鹽水洗滌紅細胞3次。
3.5 用生理鹽水將紅細胞稀釋至適合的濃度，用于血型檢測。
適用場景三
處理紅細胞后進行自身抗體的吸收
1、原理：ZZAP試劑由1%半胱氨酸激活的木瓜酶溶液、0.2M DTT,PH 6.5 PBS組成，聯(lián)合應(yīng)用蛋白酶（木瓜酶或無花果酶）和二硫蘇糖醇（DTT），破壞和解離紅細胞膜上抗體。IgG分子經(jīng)巰基試劑處理后增加對蛋白酶消化的敏感性。當包被了IgG分子紅細胞用ZZAP 試劑處理后，IgG分子失去其完整性，并從紅細胞膜上解離下來，蛋白酶的作用是增加處理后紅細胞的吸收能力。
2、適用范圍：用于在免疫溶血性疾病的實驗診斷中處理紅細胞，用于吸附除去血清標本中游離的溫自身抗體和冷自身抗體，對其中的同種異體抗體進行檢測。也可用于消除自身紅細胞凝集現(xiàn)象。
3、操作步驟：
3.1冷抗體自身吸收
3.1.1 將ZZAP試劑2m1加入2m1壓積的自身紅細胞，混合，37℃，20-30min。
3.1.2 生理鹽水洗滌3次，最后一次徹底去除上清。
3.1.3 加入2m1自身血清，混合，4℃，30-40min。
3.1.4 900-1000g離心4-5min，將血清移至另一干凈的試管中。
3.1.5 如吸收效果不滿意，可重復(fù)步驟3.1.1至3.1.4。
3.1.6 最后一次吸收后用試劑紅細胞檢測血清中的同種異體抗體。
3.2 溫自身抗體的自身吸收
3.2.1取兩支試管，各加1m1壓積的自身紅細胞，2m1 ZZAP試劑混合，不時搖動試管，37℃，20-30min。
3.2.2生理鹽水洗滌細胞3次，最后一次徹底除去上清。
3.2.3加入同體積血清至ZZAP 處理過的紅細胞，混合，37℃，20-45min。
3.2.4 900-1000g離心4-5min，收集血清。
3.2.5重復(fù)步驟3、4，將血清再吸收一次，離心，收集血清。
3.2.6用該血清與紅細胞譜試劑反應(yīng)，檢測同種異體抗體。
3.3.ZZAP處理異源紅細胞吸收病人自身抗體
3.3.1 R1R1、R2R2、rr三種O型紅細胞，生理鹽水洗滌紅細胞，離心壓積，去除上清。
3.3.2 每一體積細胞加入兩體積的ZZAP試劑，混勻，37℃，20-30min，不斷搖動。
3.3.3 生理鹽水洗滌紅細胞3次，最后一次徹底去除上清。
3.3.4 將處理的紅細胞與病人血清同體積混合，37℃，30-60min，不斷搖動。
3.3.5 900-1000g離心4-5min，收集血清。
3.3.6 將吸收過的血清與新的紅細胞（與吸收用的紅細胞為同一人份）混合，如反應(yīng)，重復(fù)吸收過程直至無反應(yīng)。
3.3.7 用吸收過的血清與紅細胞譜試劑反應(yīng)，檢測同種異體抗體。比較存在和除去的同種異體抗體活性。
適用場景四
處理紅細胞后進行抗體檢測
1、原理：二硫蘇糖醇（DTT）是有效的還原劑，能破壞半胱氨酸殘基之間的共價鍵，從而影響抗原蛋白的二級結(jié)構(gòu)。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)識別抗原的抗體在抗原蛋白結(jié)構(gòu)破壞后不與該抗原反應(yīng)。KELL血型系統(tǒng)抗原對DTT非常敏感。Knops血型系統(tǒng)抗體及抗-LWa,抗 -Yta, 抗-Ytb, 抗-Doa, 抗-Dob, 抗-Gya, 抗-Hy和抗-Joa等抗體不與DTT處理后的細胞處理。
2、適用范圍：這種抑制技術(shù)有助于識別部分抗體或確定血清是否含有其他潛在的同種抗體和靶向藥物達雷妥尤（抗-CD38）干擾的不規(guī)則抗體篩選、交叉配血等血清學(xué)試驗。
3、操作步驟
3.1 DTT溶液（0.2 M DTT ，pH 8）和PBS洗滌的壓積紅細胞以4：1混合。
3.2 在37℃孵育30～45分鐘,每5分鐘混勻一次。推薦30min以上
3.3 用PBS洗滌4次。可能發(fā)生輕微的溶血；如果溶血過多，可使用略小體積的DTT（2-3倍體積）洗滌新鮮的紅細胞，重復(fù)以上步驟。推薦3400r，1min
3.4 用PBS制成2%～5%紅細胞懸液。
3.5 用含有可疑抗體的血清測試DTT處理的細胞。
3.6 選擇E+紅細胞為陽性對照細胞，K+紅細胞為陰性對照。DTT處理后分別用抗-E和抗-K血清測試對應(yīng)的細胞，陽性細胞出現(xiàn)陽性反應(yīng)，陰性細胞陰性反應(yīng)才可證明DTT處理有效。
適用場景五
轉(zhuǎn)化IgG型抗體直接凝集細胞[2]
1、原理：IgG型抗體分子有抗體重鏈和兩條輕鏈由二硫鍵（S-S）連接而成。使用巰基試劑去除連接在兩條重鏈的二硫鍵能增加IgG鉸鏈區(qū)的靈活性，能增加IgG分子的Fab端抗原結(jié)合位點之間的距離，修飾后的IgG型分子在低蛋白介質(zhì)（鹽水）中能直接凝集紅細胞。
2、適用范圍：將紅細胞致敏后不能導(dǎo)致紅細胞凝集效價≥32的IgG型抗體轉(zhuǎn)化為能直接凝集紅細胞的IgG型抗體。
3、操作步驟：
3.1 準備2支試管分別加入1mL含有效價≥32的IgG型抗體的血清。
3.2 1支試管中加入1mL 0.01mol/L DTT，另一支對照試管中加入1mL pH 7.3 PBS。
3.3 室溫孵育30分鐘或37℃ 15min。
3.4 加入存在該IgG型抗體特異性抗原的紅細胞后立即離心 3100r/min 15秒，立即肉眼觀察并記錄結(jié)果。
4.注意事項：
1）對照管不能凝集紅細胞說明試驗成立。
2）檢測管血清能直接凝集紅細胞，說明IgG型抗體轉(zhuǎn)化成功；如檢測管血清不能直接凝集紅細胞，說明IgG型抗體轉(zhuǎn)化不成功，可能因為抗體效價低的原因。
參考文獻：
[1] 沈偉，陳偉．劉鳳霞.紅細胞血清學(xué)技術(shù) [M].長沙：中南大學(xué)出版社，2022：176.
[2] W John Judd, Susan T Johnson, Jill Storry, et al. Judd's Methods in Immunohematology 3rd[M]. Bethesda MD:AABB Press, 2008,p239.
