組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交，而原位雜交是經適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補序列在胞內的空間位置，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規定序列的位置，對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質內的功能排布；與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。
用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針操作的長度以100-400nt為宜，過長則雜交率減低。最近研究結果表明，寡核苷酸探針（16-30 nt）能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針，因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉錄標記的RNA探針是組織原位雜交優選探針。
探針的標記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，3H標記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點是能量低，35S標記探針活性較高，影像分辨率也較好，而32P能量過高，致使產生的影像模糊，不利于確定雜交位點。
原位雜交中，標本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標本組織蛋白質的消化程度對探針進入細胞極為重要，去除蛋白質的方法是，用0.2mol/L HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術，發展很快，在敏感性、特異性、穩定性上還需進一步完善和提高。