擬南芥（Arabidopsis thaliana）是一種模式植物，具有基因組小（125 Mbp）、生長周期短等特點(diǎn)，而且基因組測(cè)序已經(jīng)完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同時(shí)，擬南芥屬十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特點(diǎn)，擬南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括農(nóng)作物的研究，產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益，特別是十字花科中還有許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)，因此目前擬南芥的研究越來越多地受到國際植物學(xué)及各國政府的重視。

從遺傳學(xué)的觀點(diǎn)來看，基因克隆的途徑可概括為正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)兩種。正向遺傳學(xué)途徑指的是通過被克隆基因的產(chǎn)物或表現(xiàn)型突變?nèi)ミM(jìn)行；反向遺傳學(xué)途徑則指的是依據(jù)被克隆基因在染色體上的位置來實(shí)現(xiàn)。雖然一些模式生物（如擬南芥）的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，但還有40%的基因（在擬南芥中）的功能還是未知的。

圖1 圖位克隆所需努力的比較（1995年和2002年）（Jander等， 2002）

圖位克隆（map-based cloning）又稱定位克隆（positional cloning），1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的，無需預(yù)先知道基因的DNA序列，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息。它是通過分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定突變表型的遺傳基礎(chǔ)。近幾年來隨著擬南芥基因組測(cè)序工作的完成，各種分子標(biāo)記的日趨豐富和各種數(shù)據(jù)庫的完善，在擬南芥中克隆一個(gè)基因所需要的努力已經(jīng)大大減少了（圖1）。

目前完成整個(gè)擬南芥的圖位克隆過程大約需要一年時(shí)間。在這個(gè)過程中，我們從篩選突變體開始，逐漸找到和表型相關(guān)的基因。這和反向遺傳學(xué)的方法正好相反。圖位克隆能實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵在于全基因組測(cè)序計(jì)劃的完成和各種分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)被儲(chǔ)存在專門的數(shù)據(jù)庫中（表1）（Lukowitz等， 2000）。在擬南芥中的圖位克隆，在很大程度上得益于對(duì)Col-0生態(tài)型測(cè)序的完成，因?yàn)樗�是在研究擬南芥時(shí)最常用的生態(tài)型。

實(shí)現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。實(shí)質(zhì)上，分子標(biāo)記是一個(gè)特異的DNA片段或能夠檢出的等位基因，對(duì)其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。迄今為止，已有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選（Wang等，2000）。其中最為常用的是簡單序列長度多態(tài)性（SSLPs）（Lukowitz等， 2000； Choe等， 2002； Gonzalez-Guzman等， 2002）。和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）（Rafalski， 2002）。SSLP是基于PCR的分子標(biāo)記，在擬南芥基因組中有較多分布，而且是共顯性的，它的檢測(cè)非常直接，但是我們需要設(shè)計(jì)引物來檢測(cè)假定的SSLP標(biāo)記；對(duì)SNPs標(biāo)記的檢測(cè)也比較直接，它是擬南芥不同生態(tài)型之間基因組中的單個(gè)核苷酸的差別，這些差別的核苷酸通常位于不編碼區(qū)域（Peters等， 2003）。最常見的用于檢測(cè)SNPs標(biāo)記的方法主要是剪切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS），它也是基于PCR的。另外，一種更為有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam等， 1989； Michaels 和 Amasino， 1998）可把任何已知的點(diǎn)突變作為分子標(biāo)記，只要在PCR是引入不配對(duì)的引物，使擴(kuò)增的序列在一個(gè)生態(tài)型中具有限制性酶切位點(diǎn)，而在另一生態(tài)型中沒有，以形成多態(tài)性。

圖位克隆法隨著相關(guān)配套技術(shù)（序列數(shù)據(jù)庫、分子標(biāo)記等）的日漸成熟，許多擬南芥及一些農(nóng)作物的基因已被成功的克隆（表2）。本文擬對(duì)圖位克隆的研究進(jìn)展做一介紹，以期對(duì)植物遺傳育種和分子生物學(xué)研究有所幫助

表1 擬南芥網(wǎng)絡(luò)資源

因?yàn)橛辛藬M南芥的基因組序列和高密度的遺傳標(biāo)記，圖位克隆過程就變得相對(duì)直接。圖2例舉了一種高效的擬南芥圖位克隆方法。從基于Col-0和Ler遺傳背景的突變體出發(fā)，我們有可能在大約一年時(shí)間內(nèi)找出與這個(gè)突變相關(guān)的基因，這其中主要耗時(shí)間的是五個(gè)植物（擬南芥）的生長周期（我們假定每個(gè)周期為兩個(gè)月）。

作為作圖過程的第一步，突變體植株將和另外一個(gè)生態(tài)型（Col-0或者Ler）的植株雜交。在大多數(shù)情況下，用于雜交的突變體植株是作為父本還是母本是沒有關(guān)系的。然后播種F1代種子。在F1代植物的生長過程中，我們就有可能來對(duì)其表現(xiàn)型和基因型進(jìn)行分析。F1代植物的表型的出現(xiàn)或者消失將顯示著我們所研究的突變是顯性的還是隱性的。最好通過對(duì)一些標(biāo)記的分析來確認(rèn)F1代植物是雜合體，而且在雜交過程中我們沒有犯錯(cuò)誤。當(dāng)然也有必要確認(rèn)原來的生態(tài)型背景。

表2 用圖位克隆方法得到的擬南芥及一些農(nóng)作物的基因

基因	突變表型	基因同源序列
AB13	脫落酸不敏感	玉米轉(zhuǎn)錄子
FID3	降低亞油酸飽和度	細(xì)菌去飽和酸酶
AXR1	生長素抗性	泛素N 端活性酶
ETR1	乙烯抗性	雙因子調(diào)節(jié)子
ABI1	脫落酸不敏感	鈣調(diào)蛋白磷酸化酶
DET1	黃化損傷反應(yīng)	新核蛋白
RPS2	抗病	新型富含亮氨酸的蛋白酶
RPM1	抗病	激酶
RSW1	纖維素合成酶	細(xì)胞色素P450 家系
ZLL	調(diào)節(jié)中莖分生	細(xì)胞胚胎發(fā)育蛋白
PRT1	抑制胞間蛋白降解	控制植物N 端代謝
Tornadol	植株短化	——
IFL1	正常的維管束間纖維分化受阻	亮氨酸拉鏈蛋白
ARA1	樹膠醛糖激酶活性喪失	半乳糖激酶基因家族
VTC2	維生素C合成不足	果蠅蛋白CG3552，線蟲蛋白C10F3.4（功能未知）
AST	種皮花青苷斑點(diǎn)	花青苷生物合成途徑中的二氫黃酮醇-4-還原酶

圖2 圖位克隆過程示意圖（Jander等， 2002）

F1代植物自交得到F2代種子，大約播種600個(gè)個(gè)體以進(jìn)行突變基因的粗定位（first-pass mapping，圖2）。在其生長過程中，我們可確定其表型，大約有150個(gè)個(gè)體被認(rèn)為是純合體（在隱性突變的情況下是純合突變體，在顯性突變的情況下是純合野生型）。然后從這150個(gè)個(gè)體的葉子或者其它組織中制備DNA用于基因型分析。起先用分布于擬南芥五條染色體上的25個(gè)標(biāo)記（相鄰的兩個(gè)標(biāo)記之間大約相距20 cM）進(jìn)行分析，確定突變基因是和哪個(gè)或者哪幾個(gè)標(biāo)記是連鎖的，然后用三點(diǎn)測(cè)交的方法來定義一個(gè)包含突變基因的大約20 cM的遺傳間隔。一旦這樣的一個(gè)遺傳間隔被定義之后，接下來的工作就是引入新的標(biāo)記把這個(gè)間隔縮小到大約4 cM。一般來說，利用150個(gè)F2代個(gè)體是在很大程度上能找到這樣一個(gè)遺傳間隔的，距離突變基因最近的兩個(gè)分子標(biāo)記將作為側(cè)面標(biāo)記而用于下面的進(jìn)一步分析。

下一步我們將播種一個(gè)更大的F2代群體用于突變基因的精細(xì)定位（fine-resolution mapping，圖2）。最終目標(biāo)是將包含突變基因的遺傳間隔縮小到40 Kb甚至更小（這在擬南芥中大約是0.16 cM）。顯然用于作圖的F2代植物越多，就越能精確地定位突變基因。一般需要3000~4000個(gè)F2代植物個(gè)體（包括粗定位時(shí)的600個(gè)F2代植物個(gè)體）來精確地定位突變基因。但是也有很多圖位克隆過程用了少于3000個(gè)F2代植物個(gè)體就成功地定位了突變基因（Lukowitz等， 2000）。但是這往往要冒因?yàn)樽鲌D群體不夠大再一次種植F2代植物而延長整個(gè)作圖過程的時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)。

在這個(gè)大約4 cM的遺傳間隔內(nèi)找到與突變更緊密連鎖的分子標(biāo)記，一般情況下能在突變兩側(cè)找到相距小于40 Kb的兩個(gè)分子標(biāo)記。一旦這樣的兩個(gè)分子標(biāo)記被找到之后，就可以通過測(cè)序來找到突變基因。一種有效的方法是設(shè)計(jì)PCR引物來擴(kuò)增覆蓋這40 Kb的多個(gè)重疊的500 bp的片段。將這些片段測(cè)序后拼接起來以得到整個(gè)40 Kb的序列，然后將它與野生型植物（Col-0或者Ler）的序列進(jìn)行比對(duì)，這就可以找到這個(gè)區(qū)域中的多個(gè)基因。從一系列侯選基因中鑒定基因是定位克隆技術(shù)的最后一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)在最常用的方法是用含有目標(biāo)基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去篩選cDNA文庫，并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫，待找出侯選基因后，把這些侯選基因進(jìn)行下列分析以確定目標(biāo)基因：（1）精確定位法檢查cDNA是否與目標(biāo)基因共分離；（2）檢查cDNA時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)是否與表型一致；（3）測(cè)定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫，以了解該基因的功能；（4）篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關(guān)系；（5）進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過轉(zhuǎn)化突變體觀察突變體表型是否恢復(fù)正常或發(fā)生預(yù)期的表型變化。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)是最直接、最終鑒定基因的方法。利用新興的RNA干擾（RNAi）也可有效地確定目的基因。

圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術(shù)來定位基因。

在分析自然發(fā)生的變異的時(shí)候，我們最有可能遇到的復(fù)雜情況是一個(gè)給定的性狀是由不止一個(gè)的基因位點(diǎn)控制的。例如，在Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之間的雜交實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)粉狀霉菌抗性基因至少涉及三個(gè)遺傳位點(diǎn)，它們是以附加的方式起作用的（I.Wilson， C. Schiff， 和 S. Somerville，個(gè)人交流）。對(duì)這些抗性基因中的任何一個(gè)作精細(xì)定位都要求降低作圖群體的遺傳復(fù)雜性，例如通過創(chuàng)造只有一個(gè)位點(diǎn)保持多態(tài)性的重組近交系。在擬南芥的株系之間雜交時(shí)，很多種性狀是由一個(gè)或多個(gè)遺傳位點(diǎn)控制的，其中包括開花時(shí)間，種子大小，冬眠，生理節(jié)律，次生代謝以及表皮毛的密度（綜述見Alonso-Blanco 和 Koornneef，2000）。無論何時(shí)，當(dāng)影響這些性狀的自然或者誘導(dǎo)的突變被定位的時(shí)候，第二位點(diǎn)修飾成分會(huì)干擾這些分析。

表觀（上位）遺傳突變這個(gè)術(shù)語是描述一個(gè)基因在表達(dá)和功能上的可遺傳改變，而不涉及DNA序列的改變（綜述見Wolffe 和 Matzke,1999），這是圖位克隆工程中又一個(gè)可能的復(fù)雜情況。已有文獻(xiàn)很好地證明的是花發(fā)育基因SUPERMAN的后生clark kant等位基因（Jacobson 和 Meyerowitz，1997）。這些等位基因是可遺傳的，但它們不穩(wěn)定有一個(gè)小的回復(fù)率。它們?cè)?em>SUPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化現(xiàn)象，結(jié)果，有可能減少了SUPERMAN基因轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)。它們中沒有一個(gè)是和SUPERMAN的DNA序列改變聯(lián)系在一起的；盡管如此，它們能被帶有SUPERMAN基因的轉(zhuǎn)基因所補(bǔ)充。目前，對(duì)于這種表觀遺傳突變是怎么產(chǎn)生的以及它們出現(xiàn)的頻率知道的不多。

關(guān)于染色體上位點(diǎn)的物理和遺傳距離的比值是變化的。通常這種變化是比較小的，對(duì)作圖的分辨率也只有較小的影響（Copenhaver等，1998）。但是，有證據(jù)表明有些染色體區(qū)域是例外的。例如，對(duì)GURKE基因的圖位克隆就非常困難，這個(gè)基因的定位接近于第一條染色體的著絲粒；在著絲粒附近重組是嚴(yán)格限制的，使得對(duì)它精細(xì)定位的努力非常無效。而且，在這個(gè)區(qū)域中重復(fù)DNA單元的廣泛分布使我們辨認(rèn)出散布的單拷貝序列，這些單拷貝序列能產(chǎn)生有疑問的遺傳標(biāo)記（R. Torres Ruiz，個(gè)人交流）。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是經(jīng)過對(duì)第二條染色體上的物理和遺傳距離之間的比值的系統(tǒng)地分析之后確認(rèn)的（Lin等，1999）。對(duì)這條染色體的幾乎全序列，1%重組的遺傳距離相當(dāng)于100~400 Kb的物理距離，平均是250 Kb。然而著絲粒區(qū)域是一個(gè)顯著的例外，在這里1%重組的遺傳距離相當(dāng)于1000~2500 Kb。看來值得指出的是在現(xiàn)存的物理圖譜中，擬南芥的五個(gè)著絲粒是沒有一個(gè)被完全覆蓋的。最近對(duì)著絲粒區(qū)域的分析顯示這些區(qū)域通常包含重復(fù)的DNA和幾乎不含表達(dá)的基因（Copenhaver等，1999）。因此，由于接近著絲粒，應(yīng)該沒有擬南芥基因是不服從圖位克隆策略的。

除了著絲粒，第二條染色體上也有一個(gè)小片段上1%重組的遺傳距離相當(dāng)于1000 Kb甚至更多。根據(jù)推測(cè)，觀察到的低重組率現(xiàn)象可能是由于被用于作圖分析的株系的DNA序列的重排（Lin等，1999；Mayer等，1999）。第二和第四條染色體的DNA序列的比較顯示有些基因片段是在這兩條染色體之間被復(fù)制的（其中一個(gè)片段的大小是4.6 Mb），還有一個(gè)從線粒體基因組向第二條染色體轉(zhuǎn)移的DNA片段（Lin等，1999）。這些發(fā)現(xiàn)清楚地證明了擬南芥基因組的結(jié)構(gòu)是可以不斷改變的。因此，不同株系之間的遺傳變異可能不僅僅是由點(diǎn)突變和DNA重排導(dǎo)致的，這就從根本上給圖位克隆工程造成了嚴(yán)重的問題。舉例來說，如果在兩個(gè)株系之間發(fā)生倒轉(zhuǎn)的一個(gè)大約500 Kb的序列被用于形成的一個(gè)作圖群體，所有發(fā)生在這個(gè)倒轉(zhuǎn)內(nèi)的重組事件將產(chǎn)生不育的減數(shù)分裂產(chǎn)物。因此，不可能在這個(gè)倒轉(zhuǎn)序列內(nèi)對(duì)突變進(jìn)行作圖。到目前為止，發(fā)生在常見株系之間的這樣的DNA重排還沒有被報(bào)道過，確實(shí)應(yīng)該是這樣，因?yàn)樗鼈兒茈y被檢測(cè)到。在一個(gè)作圖實(shí)驗(yàn)中，它們的出現(xiàn)將很有可能被忽視直到最后一步。

有時(shí)候，T-DNA插入和輻射也被觀察到能導(dǎo)致DNA的重排（Shirley等，1992；Nacry等，1998；Laufs等，1999；Ogas等，1999）。因此，當(dāng)被作圖的突變是由這些方法產(chǎn)生的時(shí)候，類似的困難也有可能產(chǎn)生。但在這些情況下，至少有一定的可能性突變是和重排的一個(gè)或兩個(gè)斷裂點(diǎn)有關(guān)。

目前，在擬南芥中的圖位克隆已經(jīng)不僅僅是一些專注的（和持久的）專家的工作了，而是每個(gè)人都能完成的工作。在過去的幾年中，產(chǎn)生了很多便宜但功能強(qiáng)大的工具，同時(shí)也有大量的信息被收集在免費(fèi)的數(shù)據(jù)庫中。利用這些資源，目前大部分的圖位克隆工程應(yīng)該是可以肯定的，直接的，也是簡單的。隨著我們對(duì)擬南芥基因組結(jié)構(gòu)和變化的認(rèn)識(shí)的增長，情況將進(jìn)一步改善，因?yàn)檫@將有助于我們消除部分上面提到的仍然存在的復(fù)雜情況，或者至少使得它們可被控制。