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細胞系或細胞株的建立

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-08

各種已被命名和經過細胞生物學鑒定的細胞系或細胞株,都是一些形態比較均一、生長增殖比較穩定的和生物性狀清楚的細胞群。因此凡符合上述情況的細胞群也可給以相應的名稱,即文獻中常稱之為已鑒定的細胞(Certified Cells)。已鑒定的細胞可用于各種實驗研究和生產生物制品。當前世界上已建的各種細胞系(株)已難勝數,我國也建有百種以上,并在不斷增長中。
一、體外培養細胞的種類和命名
體外培養細胞的名稱,隨培養細胞技術的發展和細胞種類的增多而演變。最早采用的名稱為細胞株(Cell strain),以后又出現細胞系(Cell Line)一詞,兩者曾一度混用致概念不明確,導致文獻中也很混亂。我國也曾有類似情況,在我國尚未制定出統一名詞前,本書用的名詞基本參考Schaeffer,W.I.(1979)和國內有關會議、以及國內外雜志常用名詞為準。
(一)初代培養
初代培養又稱原代培養,即直接從體內取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養物。一旦已進行傳代培養(Subculture)的細胞,便不再稱為初代培養,而改稱為細胞系。
(二)細胞系
初代培養物開始第一次傳代培養后的細胞,即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限,則稱之為有限細胞系(Finite Cell Line);已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系,稱連續細胞系或無限細胞系(Infinite Cell Line)。無限細胞系大多已發生異倍化,具異倍體核型,有的可能已成為惡性細胞,因此本質上已是發生轉化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性(或不死性),但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性;有的不僅有永生性,異體接種也有致瘤性,說明已惡性化。這兩種不同性質的無限細胞系,在國內外文獻中對這些名詞的應用上也常不十分嚴格。為概念上的明確,對有惡性的無限細胞系采用“惡性轉化細胞系”一詞表示可能更妥。而對那些只具永生性而無惡性的細胞系,則用無限細胞系或轉化細胞系即可。當前流傳的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均屬這類細胞系。
由某一細胞系分離出來的、在性狀上與原細胞系不同的細胞系,稱該細胞系的亞系(Subline)。
(三)克隆細胞株
從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群,稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養出與原株性狀不同的細胞群,亦可稱之為亞株(Substrain)
(四)二倍體細胞
細胞群染色體數目具有與原供體二倍細胞染色體數相同或基本相同(2n細胞占75%或80%以上)的細胞群,稱二倍體細胞培養。如僅數目相同,而核型不同的即染色體形態有改變者為假二倍體。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期,故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不同,二倍體細胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細胞可傳50代土10代,人胚腎只有8~10代,人胚神經膠質細胞15~30代;如從老齡個體取可傳50則細胞生存期更短。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用,一般在初代或2~5代即大量凍存作為原種(Stook Cells),用時再進行繁殖,用后再繼續凍存,可供長期使用或延緩細胞的衰老。
(五)遺傳缺陷細胞
從有先天遺傳缺陷者取材(主要為成纖維細胞)培養的細胞,或用人工方法誘發突變的細胞,都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型,也可呈異倍體。
(六)腫瘤細胞系或株
這是現有細胞系中最多的一類,我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成,多呈類上皮型細胞,常已傳幾十代或百代以上,并具有不死性和異體接種致瘤性。
對已建成的各種細胞系或細胞株習慣上都給以名稱;細胞的命名無嚴格統一規定,大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什么形式,均不宜太長,以便記憶和了解,今別舉以下幾種代表性的細胞名稱供參考:
HeLa:為供體患者的姓名(來源于宮頸癌)
CHO:中國地鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary)
宮-743:宮頸癌上皮細胞,1974年3月建立
NIH3T3:美國國立衛生研究所(National Institute of Health)建立;每3天傳代,每次接種3×105細胞/毫升。
二、建立細胞系(或株)的要求
關于什么樣的體外培養細胞群,可被確認為是已被鑒定的細胞(Certified Cells),國際上也尚無統一的規定,一般依具體情況而定。在只用作初代培養細胞,只要供體性別、年齡等均一,取材部位及組織種類等條件穩定,做鑒定的項目無需很多,有幾項能說明細胞的相關性狀的即可。如能長期保存并可供其它研究室使用,特別是做反復傳代的細胞,習慣上有以下一些要求,并在刊物上報道時應加以說明。
(-)組織來源
應說明細胞供體所屬物種,來自人體,動物或其它;供體的年齡、性別、取材的器官或組織;如系腫瘤組織,應說明臨床病理診斷,組織來源,以及病例號等。
(二)細胞生物學檢測
應了解細胞一般和特殊的生物學性狀,如細胞的一般形態、特異結構、細胞生長曲線和分裂指數、倍增時間、接種率;特異性,如為腺細胞有否特殊產物包括分泌蛋白或激素等;如為腫瘤細胞,應力求證明細胞確系來源于原腫瘤組織而非其它,并仍保持性性,為此需做軟瓊脂培養、異體動物接種致瘤性和對正常組織浸潤力等實驗。
(三)培養條件和方法
各種細胞都有自己比較適應的生存環境,因此應指明使用的培養基、血清種類、用量以及細胞生存的適宜pH等。

三、若干細胞建株的要點及基本過程
(一)腫瘤細胞培養技術要點
1、取材:材料主要來源于外科手術或活檢瘤組織,取材時避免用壞死組織,要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位,瘤性轉移淋巴結或胸腹水是較好的培養材料。取材后盡快培養,因故不能立即培養者,可凍存。其培養方法及凍存方法同前述正常組織。
2、成纖維細胞排除:在腫瘤組織中;祀s有一些成纖維細胞,培養時能與瘤細胞同時生長,并常壓過癌細胞,導致癌細胞生長受阻以至消失,應仔細排除。
排除方法常有:機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。
3、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率
根據實驗經驗,腫瘤細胞在體外不易培養,建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養后,要經過對新環境的適應才能生長,因此不能局限于一般培養法,須采用一些特殊措施。如:用適宜底物,鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子,根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子,如胰島素、氫化可的松,雌激素等。也可以考慮動物媒介培養。
(二)人類淋巴母細胞建株方法
l、4ml肝素抗凝血于離心管中,加入2ml RPMI 1640。
2、混勻后沿管壁緩慢加到預置有4ml淋巴細胞分離液的液面上靜置30min。
3、1500rpm,15min,吸取白細胞層(第二層)于另一離心管中。
4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細胞兩次。
5、將白細胞接種至1ml RPMI 1640培養基中,加入10μl環胞霉素和100μl的EBV(EB病毒)液,混勻。
6、水浴搖床,40次/分,37℃,3hr。
7、1500rpm,15min。將細胞接種至1ml培養基中(內含谷氨酰胺1mM/ml)加入10μl環胞霉素,輕輕混勻,37℃培養。
8、5天后觀察細胞轉化和生長情況,決定是否半量換液。一般半量換液l—2次,并維持環胞霉素的濃度。
9、待轉化細胞數量明顯上升,并出現細胞團塊后,可轉入25ml細胞培養瓶中,加1—2ml培養基,37℃培養10—15天,一般每隔3—4天觀察一次,決定是否換液,傳代。
10、細胞生長達一定數量后凍存,凍存前應進行核型分析和存檔。


四、已建立細胞系或株的鑒定、管理和使用
近些年,當一個細胞系或細胞林建成后,我國常通過組織專家開鑒定會的形式予以鑒定,從學術角度考慮,此舉實非必要。按國際慣例,只要研究認真負責地把有關資料在雜志或刊物上報道,詳細介紹上述各項目即可。
以前因未建立統一的細胞庫時,對已建立的細胞系(株)多由作者單位自行保管,有浪費人力、交流使用不便、細胞易污染和丟失等弊病。我國已初建成小規模貯存細胞機構,待獲進一步發展,這對我國細胞培養必將有更大促進作用。
國際上美、英和日本等國已建有細胞庫;美國已有美國標準細胞庫或細胞銀行(ATCC)和人遺傳突變細胞庫(HGMR)、細胞衰老細胞庫(CAR)等,其中ATCC不僅是美國也世界最大的細胞庫。ATCC下屬有一組協作實驗室和一個由眾多專家組成的咨詢委員會。ATCC也是美國國立癌癥研究所(NCI)和美國衛生研究所中(NIH)的資源庫,尤與NCI有密切的關系。ATCC也是世界衛生組織WHO的國際培養細胞文獻中心。ATCC現液氮凍存有3200個已經過鑒定的細胞系(1992),其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細胞系;和來自不同物種的近75個雜交瘤細胞株。ATCC接納來自世界各國已經鑒定的細胞予以貯存,同時也向世界各國的研究者或實驗室免費提供研究用細胞(做盈利性研究時收費。) ATCC接納入庫細胞時,必須符合其入庫標準, ATCC入庫細胞要求檢測項目如下:
培養簡歷:組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態、細胞已傳代數等
凍 存 液:培養基和防凍液名稱
細胞活力:融解前后細胞接種存活率和生長特性
培 養 液:培養基種類和名稱(一般要求不含抗生素)、血清來源和含量
細胞形態:類型,如為上皮或成纖維細胞等,融解后細胞生長特性
核 型:二倍體或多倍體,標記染色體的有無
無污染檢測:包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等
物種檢測:檢測同工酶,主要為G6PD和LDH,以證明細胞有否交叉污染以及反轉錄酶檢測
免疫檢測:一兩種血清學檢測
細胞建立者:建立者姓名;檢測者姓名
以上為ATCC入庫基本要求,雜交瘤入庫標準尚有所不同,詳細情況請參閱ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”。

 
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