分為六個階段：

階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

[階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈]

1．在置于冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：

poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

1mol/L KCl 3.5μl

250 mmol/L MgCl₂ 2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L） 10μl

0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制劑（選用） 25單位

加H₂O至 48μl

2．當所有反應組在0℃混合后，取出2.5μl反應液轉移到另一個0.5ml微量離心管內。在這個小規模反應管中加入0.1μl [α-³²P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3．大規模和小規模反應管都在37℃溫育1h。

4．溫育接近結束時，在含有同位素的小規模反應管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后將反應管轉移到冰上。大規模反應管則在70℃溫育10 min，然后轉移至冰上。

5．參考《分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法，測定0.5μl小規模反應物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規模反應產物進行分析是值得的。

6．按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）：

[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)

7．盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。

[階段2：cDNA第二鏈的合成]

1．將下列試劑直接加入大規模第一鏈反應混合物中：

10 mmol/L MgCl₂ 70μl

2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl

10 mCi/ml[α-³²P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl

1 mol/L (NH₄)₂SO₄ 1.5μl

RNase H (1000單位/ml) 1μl

大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml) 4.5μl

溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。

2．溫育結束，將下列試劑加到反應混合物中：

β-NAD (50 mmol/L) 1μl

大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml) 1μl

室溫溫育15min。

3．溫育結束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應混合物室溫溫育15分鐘。

4．取出3μl反應物，按步驟7和8描述的方法測定第二鏈DNA的質量。

5．將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。

6．將下列試劑加到DNA溶液中：

10×T4多核苷酸激酶緩沖液 10μl

T4多核苷酸激酶（3000單位/ml） 1μl

室溫溫育15分鐘。

7．測定從上面步驟4取出的3μl反應物中放射性活度，并按分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法測定1μl第二鏈合成產物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。

8．用下面公式計算第二鏈反應中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。

[第二鏈反應中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg

x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%

9．用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應物進行抽提。

10． Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。

11． 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機上以最大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。

12． 用70%乙醇洗滌沉淀物，重復離心。

13． 小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。

14． 如果需要用EcoR I甲基化酶對cDNA進行甲基化，可將cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進行cDNA合成的下一步驟。

[階段3：cDNA的甲基化]

1．在cDNA樣品中加入以下試劑：

2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl

5 mol/L NaCl 2μl

0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl

20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl

加H₂O至 96μl

2．取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。

3．在余下的反應混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000單位/ml），保存在0℃直至步驟4完成。

4．再從大體積的反應液中吸出另外兩小分樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號和4號。

5．在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100 ng質粒DNA或500 ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預實驗中用作底物以測定甲基化效率。

6．所有四份小樣實驗反應和大體積的反應均在37℃溫育1h。

7．于68℃加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應液一次，再用氯仿抽提一次。

8．在大體積反應液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應結果。

9．按下述方法分析4個小樣對照反應：

a. 在每一對照反應中分別加入：

0.1 mol/L MgCl₂ 2μl

10×EcoR I 緩沖液 2μl

加H₂O至 20μl

b. 在2號和4號反應管中分別加入20單位EcoR I。

c. 四個對照樣品于37℃溫育1h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

10． 微量離心機以最大速度離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl 70%乙醇洗滌沉淀，重復離心。

11． 用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29μl TE（pH8.0）。

12． 盡可能快地進行cDNA合成的下一階段。

[階段4：接頭或銜接子的連接]

cDNA末端的削平

1．cDNA樣品于68℃加熱5 min。

2．將cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑：

5×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 10μl

dNTP溶液，每種5 mmol/L 5μl

加H₂O至 50μl

3．加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位/ml），37℃溫育15min。

4．加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以終止反應。

5．用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。

6．在柱流出液中加入0.1倍體積的3 mol/L 乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4℃至少放置15 min。

7．在微量離心機上以最大速度離心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀經空氣干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).

接頭-銜接子與cDNA的連接

8．將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 2μl

800~1000 ng的磷酸化接頭或銜接子 2μl

T4噬菌體DNA連接酶（10⁵ Weiss單位/ml） 1μl

10 mmol/L ATP 2μl

混勻后，在16℃溫育8~12h。

9．從反應液中吸出0.5μl貯存于4℃，其余反應液于68℃加熱15min以滅活連接酶。

[階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA]

Sepharose CL-4B柱的制備

1．用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進1ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

2．將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內充滿緩沖液，用止血鉗關閉軟管。

3．在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數分鐘，放開止血鉗，當緩沖液從吸管滴落時，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基質幾乎充滿吸管為止。

4．將幾倍柱床體積的含0.1 mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關閉柱子底部的軟管。

依據大小分離回收DNA

5．用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50μl或更小），放開止血鉗，使cDNA進入凝膠。用50μl TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。

6．用手提式小型探測器監測cDNA流經柱子的進程。放射性cDNA流到柱長2/3時，開始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。

7．用切侖科夫計數器測量每管的放射性活性。

8．從每一管中取出一小份，以末端標記的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片斷作標準參照物，通過1%瓊脂凝膠電泳進行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。

9．電泳后將凝膠移至一張Whatman 3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前20min至30min于50℃加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態繼續干燥1~2h.

10． 置-70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續X射線曝光。

11． 在cDNA長度≥500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機于4℃以12 000g離心15min，以回收沉淀的cDNA。

12． 將DNA溶于總體積為20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。

13． 測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于λ噬菌體臂相連接的DNA總量。

[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA

[階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接]

1．按下述方法建立4組連接-包裝反應：

連接	A(μl)	B(μl)	C(μl)	D(μl)
λ噬菌體DNA(0.5μg/μl)	1.0	1.0	1.0	1.0
10×T4DNA連接酶緩沖液	1.0	1.0	1.0	1.0
cDNA	0 ng	5 ng	10 ng	50 ng
T4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml）	0.1	0.1	0.1	0.1
10 mmol/L ATP	1.0	1.0	1.0	1.0
加H2O至	10	10	10	10

連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲存于-20℃。

2．按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。

3．包裝反應完成后，在各反應混合物中加入0.5ml SM培養基。

4．預備適當的大腸桿菌株新鮮過夜培養物，包裝混合物做100倍稀釋，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培養8~12小時。

5．計算重組噬菌斑和非重組噬菌斑，連接反應A不應產生重組噬菌斑，而連接反應B、C和D應產生數目遞增的重組噬菌斑。

6．根據重組噬菌斑的數目，計算cDNA的克隆效率。

7．挑取12個重組λ噬菌體空斑，小規模培養裂解物并制備DNA，以供適當的限制性內切核酸酶消化。

8．通過1%瓊脂凝膠電泳分析cDNA插入物的大小，用長度范圍500bp~5kb的DNA片段作為分子質量參照。