一、 定性和定量研究
只定性的研究方法：常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）
進(jìn)行定量或半定量的研究方法：各種流式細(xì)胞儀方法、原位末端標(biāo)記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。
二、區(qū)分凋亡和壞死
可將二者區(qū)分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡是是區(qū)分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測，AnnexinV/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測等。
不能將二者區(qū)分開的方法：原位末端標(biāo)記法、PI單染色法流式細(xì)胞儀檢測等。

三、樣品來源不同選擇
組織：主要用形態(tài)學(xué)方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進(jìn)行原位末端標(biāo)記，ELISA或?qū)⒔M織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

四、細(xì)胞凋亡檢測
1、 早期檢測:
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測
2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測
3)細(xì)胞色素C的定位檢測
4) 線粒體膜電位變化的檢測
2、 晚期檢測：
細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。
對于晚期檢測通常有以下方法：
1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)
2) LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測)
3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)
3、生化檢測：
1）典型的生化特征：DNA 片段化
2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標(biāo)記（TUNEL）等
3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記）
4）通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP （多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果�？勺黾�(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。
4、LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測)
當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時(shí)產(chǎn)生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。
上述兩種方法都針對細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細(xì)胞凋亡的檢測會(huì)受到其它原因的干擾。需結(jié)合其它的方法來檢測細(xì)胞凋亡。
其它方法：
1）Telemerase Detection (端粒酶檢測)
端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。
2）mRNA水平的檢測
研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因，檢測這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells）等靶細(xì)胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術(shù)來檢測基因表達(dá)水平無疑比之前者更快更準(zhǔn)確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達(dá)水平來進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。
5、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：
正常狀態(tài)下,谷光苷肽(GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非�；钴S時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。
6、細(xì)胞色素C的定位檢測
細(xì)胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞漿，結(jié)合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
7、線粒體膜電位變化的檢測：
1）線粒體跨膜電位的耗散與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系
2）近年來陸續(xù)有報(bào)道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過程。
3）在細(xì)胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動(dòng)態(tài)的由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點(diǎn)的通透性轉(zhuǎn)變孔道(PT孔道)能穩(wěn)定線粒體跨膜電位就能防止細(xì)胞凋亡。
線粒體在細(xì)胞凋亡作用中的進(jìn)一步證據(jù)：
1）若將純化的正常的線粒體與純化的細(xì)胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細(xì)胞核的變化。但若將誘導(dǎo)生成PT孔道的線粒體與純化的細(xì)胞核一同保溫，細(xì)胞核即開始凋亡變化。
2）形態(tài)學(xué)觀察，看到細(xì)胞數(shù)目有限，統(tǒng)計(jì)學(xué)上的準(zhǔn)確性受影響；
3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細(xì)胞的完整性也不能測出凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例；
4）流式細(xì)胞術(shù)可檢測細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平的特征性變化。
用于流式細(xì)胞儀檢測的染料：
PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。
PI和Hoechst33342雙標(biāo)：
PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細(xì)胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。
故PI著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。
PI和Annexin-V雙標(biāo)：
磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期（或細(xì)胞損傷時(shí)）PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。
Annexin-V（green）可以和磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合。因此細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死時(shí)，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細(xì)胞可能為陰性）。但是只有壞死的細(xì)胞PI是陽性

五、形態(tài)學(xué)觀察
1、普通光學(xué)顯微鏡觀察
2、透射電子顯微鏡觀察
3、熒光顯微鏡觀察
1、普通光鏡下觀察：
1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)胞），正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失
2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細(xì)胞核的色澤均一，凋亡細(xì)胞染色變深，壞死細(xì)胞染色淺或沒染上顏色
直接用倒置顯微鏡觀察：
1）細(xì)胞體積變小，全面皺縮；
2）凋亡小體為數(shù)個(gè)圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。
2、透射電子顯微鏡觀察
凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。
細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
3、熒光顯微鏡
常用的熒光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等
Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
1）PI雙染色法基本原理
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對細(xì)胞沒有太大得細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。
DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。
碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。
注意事項(xiàng)：細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。

六、細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)檢測方法:
細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ² 和Mg² 依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。
過氧化物酶標(biāo)記測定法
原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。
毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低�？沟馗咝恋奶禺愋钥贵w與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。
本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測定。
(一)試劑配制
1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。
2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。
4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。
5、TdT酶反應(yīng)液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。
6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml
7、0.05％二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。
8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。
9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、 過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（ONCOR）
（二）實(shí)驗(yàn)步驟
1、標(biāo)本預(yù)處理：
（1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。
（2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。
（3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約 5 × 107個(gè)/ml細(xì)胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細(xì)胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。
2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5min。用PBS洗兩次，每次5min。
3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。
4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37C反應(yīng) 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。
5、將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動(dòng)。
6、 組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。
9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
10、 于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。
11、 用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（三）注意事項(xiàng)
一定要設(shè)立陽性和陰性細(xì)胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標(biāo)本，陽性細(xì)胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。