本文探討了口服酵母多糖對異育銀鯽體內(nèi)免疫相關物質活性與人工感染“鰓出血”病原抗病力的影響，試驗結果證明酵母多糖可提高供試異育銀鯽體內(nèi)免疫相關物質的活性，也可增強異育銀鯽抵抗“鰓出血”病原感染的能力，對魚類的生長、體色等無不良影響。本試驗由江蘇省水產(chǎn)三新工程項目（編號：D2013-5-1）資助。

    數(shù)十年來，利用各種抗生素類藥物或者化學藥物防控養(yǎng)殖魚類的傳染性疾病是常用的措施。但是，藥物引起的病原菌耐藥性和養(yǎng)殖水體中微生態(tài)環(huán)境失衡等問題，已經(jīng)逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中日益嚴峻的問題。為了避免采用藥物防治養(yǎng)殖魚類的傳染性疾病引起的各種問題，國內(nèi)、外的研究者在利用免疫刺激劑預防養(yǎng)殖魚類傳染性疾病方面，也已經(jīng)做了不少研究工作。目前，在國外已經(jīng)有不少種類的免疫刺激劑正在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應用。

    本研究利用安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的酵母多糖投喂異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）后，檢測了供試異育銀鯽體內(nèi)免疫相關物質活性的變化與抵抗人工感染“鰓出血”病原的能力。

    1材料與方法

    1、供試異育銀鯽與飼養(yǎng)條件試驗在鹽城裕達水產(chǎn)養(yǎng)殖場池塘中設置的網(wǎng)箱中進行。將來源相同、活潑無外傷的體重為（113.5±5.5）g的異育銀鯽，仔細挑選規(guī)格相近的放在同一個網(wǎng)箱中飼養(yǎng)。在同一個池塘中放置的30個條件相同網(wǎng)箱中選擇的7個網(wǎng)箱（分別作為Ⅰ-Ⅶ組），每個4.0m×4.0m×1.5m的網(wǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)500尾異育銀鯽（圖1），在試驗期間溫度變化在17.5-25.5℃之間。每天上午8:00、中午13:00和下午16:30各投喂餌料1次，投餌量以使異育銀鯽達到飽足并有少量剩余為準。所用飼料為惠裕飼料科技有限公司生產(chǎn)的異育銀鯽專用飼料。

    2、酵母多糖用于本研究的免疫增強劑是安琪酵母股份有限公司以醫(yī)藥專用酵母生產(chǎn)的福邦牌酵母多糖，該產(chǎn)品中含有的β-葡聚糖≥20%，α-甘露聚糖肽≥20%，肽類及蛋白質≥30%，幾丁質≥2.0%。

    3、酵母多糖投喂劑量與程序根據(jù)各組試驗異育銀鯽的總體重，在定量的飼料中添加不同劑量的酵母多糖，制作成內(nèi)含不同水平的酵母多糖的顆粒飼料后分別投喂Ⅰ-Ⅵ組試驗異育銀鯽，即自I號至Ⅴ號網(wǎng)箱的投喂免疫增強劑的劑量分別為100 mg/kg.B.W、200.0 mg/kg.B.W、300.0 mg/kg.B.W、400.0 mg/kg.B.W、500.0 mg/kg.B.W和600.0 mg/kg.B.W。Ⅶ號網(wǎng)箱的試驗異育銀鯽則投喂未添加酵母多糖的飼料，作為對照組。每天投喂相當于魚體重2.5%的飼料，連續(xù)投喂28d。

    4、采血于免疫接種并投喂添加酵母多糖飼料后的第29d，從各組中分別隨機撈取15尾供試異育銀鯽，對其斷頭取血。將每尾魚的血液分為2份，其中1份以肝素抗凝，制備抗凝血，供檢測白細胞吞噬活性；將另一份血液首先在室溫下靜置1 h待其凝固，置4℃冰箱保持4 h后，于4℃條件下以4000 r/min離心10 min，收集上層血清，保存在4℃冰箱中，備用。

    5、在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mL 福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌，搖勻，在25℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min，每隔10 min搖動1次。用吸管吸取血細胞涂片，每個樣品涂5張，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗風干后，鏡檢，并依下式計算白細胞吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指數(shù)（phagocytic index，PI）。

    吞噬百分比（PP） =（100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數(shù)/100）×100

    吞噬指數(shù)（PI ）= 細胞內(nèi)總菌數(shù)/參與吞噬的細胞數(shù)

    6、溶菌酶活性的測定用0.067mol/L的磷酸緩沖液（PBS，pH 6.4）將溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）配制成0.2 mg/mL 的菌懸液。每個樣品取3.0 mL菌懸液，吸取血清0.04 mL加入到菌懸液中，混勻后，立刻在540 nm下測定A。值。然后在28℃水浴中溫育30 min，取出后置于4℃冰浴終止反應，再測定A值。計算溶菌酶活性單位：U = （A。- A）/ A 。

    7、血清中谷丙轉氨酶活性的測定采用谷丙轉氨酶試劑盒（上海科欣生物技術研究所產(chǎn)品，批號：20140706）測定。

    8、血清中總蛋白含量的測定采用血清總蛋白試劑盒（上海科欣生物技術研究所產(chǎn)品，批號：20140711）測定。

    9、攻毒從試驗和對照組網(wǎng)箱中隨機各撈取50尾供試異育銀鯽，放養(yǎng)在盛水2.0M3的圓形塑料水族箱中充氣飼養(yǎng)。在每個水族箱中放置5尾體重300.0g左右的具有“鰓出血”典型癥狀的病魚，與50尾供試魚同居飼養(yǎng)2d后將其撈出，將供試魚繼續(xù)飼養(yǎng)觀察21d。對在此期間死亡的異育銀鯽進行解剖觀察，判斷是否由于感染“鰓出血”疾病而致死，統(tǒng)計各組的死亡率，依下式計算相對免疫保護率（Relative percent survival，RPS）。

    免疫保護率（RPS）= [1-（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×1002

    結果

    1、溶菌酶活性和白細胞吞噬活性的變化投喂添加酵母多糖的飼料后，對照和試驗組異育銀鯽的血清溶菌酶活性和白細胞吞噬活性的測定結果。投喂酵母多糖的試驗組異育銀鯽的血清溶菌酶活性顯著高于對照組（t測驗，P<0.05）。白細胞吞噬活性的測定結果表明，試驗魚體白細胞的PP和PI均極顯著地高于對照組（t測驗，P<0.01）。

     2、血清總蛋白和SGPT活性的變化供試異育銀鯽的血清中總蛋白含量和SGPT活性測定結果。添加免疫多糖的試驗組魚體的血清中總蛋白含量有所提高，但是，對照與試驗組異育銀鯽血清中蛋白含量并未出現(xiàn)顯著性差別（t測驗，P>0.05）。對SGPT活性的測定結果表明，在飼料中添加酵母多糖可以降低魚體血清中SGPT的活性，但是，試驗與對照組異育銀鯽之間也并未出現(xiàn)顯著性差異（t測驗，P>0.05）。 

    3、攻毒后的存活率 對照及試驗魚在與典型病魚同居感染攻毒后，各組的死亡情況可以看出，經(jīng)過投喂酵母多糖的異育銀鯽均獲得了一定的RPS，而在飼料中添加酵母多糖的試驗組異育銀鯽死亡率明顯的低于未添加酵母多糖的對照組，與對照組相比，當酵母多糖酵在飼料中的添加量為500.0 mg/kg.B.W.時，受免異育銀鯽的獲得了最高的RPS，但是，各個添加酵母多糖的試驗組之間的RPS則未出現(xiàn)顯著性差別（t測驗，P>0.05）。

    討論

    關于異育銀鯽的“鰓出血”病，研究者們已經(jīng)用不同的方法證明了其病原是病毒。而對于魚類的病毒性疾病，目前尚無有效的藥物可以治療。本試驗結果證明了酵母多糖對這種病毒病是具有預防作用的。本研究結果不僅證明了酵母多糖對供試異育銀鯽的幾種免疫相關物質的活性具有刺激作用，而且采用將供試魚與典型病魚同居感染的方式，證明了供試魚是具有提高試驗魚抵抗病原感染的作用的。

    6個不同劑量對供試異育銀鯽血清中幾種免疫相關物質活性的差別均不是很明顯，說明在異育銀鯽的餌料中酵母多糖的添加量以100.0-600.0 mg/kg.B.W.均具有一定的作用。

    至于添加有酵母多糖餌料的投喂時間究竟以連續(xù)多長時間為宜，以及在飼料中酵母多糖的最適宜添加量等，尚需要進一步研究。

文/譯：華中農(nóng)業(yè)大學 陳昌福 胡明