現代魚病的診斷技術

　　隨著我國魚類養殖規模的不斷擴大和集約化水平的提高，各種魚類病害的發生日益頻繁，危害也越來越嚴重，已成為制約整個水產養殖業發展的最重要的因素之一。目前，在中國廣為流行的水產動物疾病（病害）就達100種以上，每年因疾病所造成的產量損失達20%以上，經濟損失可達百億元。日益嚴峻的現實使我們認識到，控制水產動物疾病已迫在眉睫，尋求水產動物病害的有效防治方法越來越受到國內外學者的廣泛關注，其中水產養殖動物病原的快速、準確檢測是對水產動物病害進行有效防治的基礎和先決條件。因此，建立水產養殖動物病原的快速、準確檢測方法和水產動物疾病的快速診斷技術不僅能直接用于水產動物病害的有效防治，還將為水產養殖業的可持續健康發展奠定良好基礎。

　　由于傳統的病原檢測方法存在靈敏度低、特異性差、費時費工等缺點，已不適應當前水產養殖業及時控制病害的要求。因此，利用現代檢測方法和技術研究開發靈敏度高、特異性強的魚類疾病快速檢測方法十分必要。近年來，隨著免疫學技術和分子生物學技術的發展，魚類病害的檢測技術已經有了長足的進步。在今后的工作中，研究特異性強、敏感性高、方便、快速的魚病診斷技術，是水產科研工作者一致的目標。

　　1、免疫學技術

　　免疫學技術是利用抗原和抗體之間的特異性反應，檢測病原微生物，該方法已經成為實驗室常用的檢測技術。目前，用于魚類疾病診斷的免疫學技術主要有單克隆抗體技術、凝集反應技術、熒光抗體技術、酶免疫技術、膠體金技術等。

　　單克隆抗體技術是利用單抗的特異性、均一性、高效性來進行疾病的診斷，該技術具有快速、簡單、靈敏度高的特點，但單克隆抗體的制備方法還有待改進。2013年，賈鵬等制備了抗傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)單克隆抗體6G7，該抗體效價高、靈敏度高，特異性強，與天然抗原親和力強忙，可用于傳染性造血器官壞死病毒的快速診斷。

　　凝集反應技術主要用于病原微生物的分型和鑒定，具有特異，快速，設備簡單，適用于基層的特點。

　　熒光抗體技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡的基礎上建立起來的一項技術，該技術的優點是特異性強，敏感度高，但對儀器設備要求過高。鄢慶枇等在2006年應用熒光抗體技術檢測牙鲆體內的弧菌。

　　酶免疫技術的方法很多，用于水產動物疾病診斷的主要是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術和斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot-ELISA)技術。該方法具有操作簡便，靈敏度高，儀器簡單，可定量的優點。戰文斌等在2014年發明了一種雙抗體夾心ELISA檢測對蝦白斑癥病毒的檢測方法；吳志新等在2009年發明了柱狀黃桿菌的Dot-ELISA檢測方法。

　　膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。運用較多的是膠體金免疫層析技術(GICA)和快速斑點免疫金滲濾技術(DIGFA)。孟小林等在2007用免疫膠體金結合免疫層析法研制了一種快速檢測對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的試劑條，并申請了專利。

　　2、分子生物學技術

　　分子生物學技術是以病原核酸為研究對象，通過對病原的核酸進行鑒定來證實病原。近年來，利用分子生物學技術對各種病原進行檢測發展非常迅速。用于魚類疾病診斷的分子生物學技術有核酸雜交技術、PCR（聚合酶鏈式反應）技術、LAMP（環介導等溫擴增）技術、限制性酶酶切檢測技術、16S rRNA檢測技術和基因芯片技術。

　　核酸雜交技術是利用特異性標記的DNA或RNA作為指示探針，使其與病原核酸中互補的靶核苷酸序列進行雜交，從而確定宿主是否攜帶某種病原體。該方法已經在多種水產動物病原體的檢測中應用。雷質文等在2001年用PCR法制備了DIG標記的探針，建立了斑點雜交檢測WSSV的方法；外國科研工作者在1991年研制了生物素標記的反意義探針檢測IHNV，該探針只能和IHNV反應并且可以識別所有的IHNV毒株。

　　PCR技術是通過酶促反應合成特異性DNA片段的方法，其用于疾病診斷是基于擴增病原的特異性DNA片段。近年來，PCR技術已經成為實驗室進行魚病診斷的常規技術，用于疾病診斷及其衍生來的PCR技術有常規PCR、套式PCR、多重PCR、免疫PCR、實時熒光定量PCR。張輝等在2012年建立了草魚出血病病毒的RT-PCR檢測方法；徐進等在2013年建立了鯉皰疹病毒2型的套式PCR檢測方法；張德鋒等在2014年建立了同時能檢測嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌的多重PCR檢測方法，可用于水生動物敗血癥的快速診斷；劉箐等在2014年建立了副溶血弧菌的免疫PCR檢測方法，其靈敏度可達到103~104cfu/mL；劉春等在2014年建立了雜交鱧彈狀病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法，最低可以檢測到10個病毒核酸分子拷貝。

　　LAMP技術是一種新的核酸擴增技術，其反應速度快、操作簡單，產物檢測方便，已被用來進行魚類疾病的診斷。張金鳳等在2013年建立了逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP) 檢測草魚出血病病毒的方法，最低檢測限為33pg，比PCR方法靈敏度高10倍。廣州迪澳生物科技有限公司的李紅梅等在2013年建立白斑綜合癥病毒的LAMP檢測方法及其檢測試劑盒，并申請了專利，該試劑盒操作簡單，適合現場檢測，特異性強，靈敏度高，可達1fg/μL。

　　限制性酶可識別DNA上較短的序列，在識別位點上切開DNA，單個核苷酸變化即可導致限制性酶切位點的增加或缺失。因此，酶切后產生的片段數目發生了改變，即所謂的限制性片段長度多態性(RFLP)。根據酶切后的DNA片段在凝膠電泳上進行分離，染色后即可觀察各個不同大小的片段，進行遺傳變異的分析。

　　16S rRNA檢測技術是基于生物體的16S rRNA的保守性和差異性建立的一種鑒定病原菌的標準方法，主要用于病原細菌的鑒定、分類。

　　基因芯片技術是將大量探針分子固定于支持物上，根據堿基互補配對原理，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布進而獲取樣品中靶分子的數量和序列信息。基因芯片技術用于魚類疾病的檢測，國內外都還處于起步階段，僅用于診斷一些主要的細菌病和病毒病。