盧林耿　俞順章　張幼辰　衛(wèi)國(guó)榮

　　關(guān)鍵詞：大腸桿菌O157；流行病學(xué)
　　大腸桿菌O157(Escherichia coli O157,E.coli O157)是一種新型的致病性大腸桿菌，能引起人類出血性腹瀉和溶血性尿毒綜合癥。其感染已成為世界性公共衛(wèi)生問題。在美國(guó)、加拿大、英國(guó)和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，都發(fā)生過E.coli O157的暴發(fā)流行；我國(guó)也有E.coli O157感染病例。

　　流行病學(xué)調(diào)查表明牛肉、牛奶、水和羊肉等是傳播E.coli O157的主要載體。在北美，牛肉中檢出E.coli O157的比例是0%～3.7%［1］，西班牙為5.1%［2］。25份來自于馬來西亞的牛肉中的9份分離到12株E.coli O157［3］。為了解上海地區(qū)E.coli O157流行情況，本文進(jìn)行了初步調(diào)查。

　　一、材料與方法
　　1.標(biāo)本來源：1997年7月至1998年6月，采集103份牛肉、34份牛奶、105份豬肉、50份污水、73份羊肉、133份腹瀉兒童患者糞便。

　　2.菌株：E.coli O157(882364，VT-)，E.coli O157(933w/o，VT＋)和E.coli ATCC 35218。

　　3.E.coli O157的分離和鑒定：25 g或ml均質(zhì)檢樣置于225 ml新生霉素(0.002%)mEC增菌液，于37℃振蕩培養(yǎng)6 h。取1 ml增菌液，20 μl抗E.coli O157免疫磁珠(挪威 Dynal公司)混合，捕獲靶細(xì)菌、沉淀，用PBS(pH 7.4)-Tween(0.000 5%)緩沖液洗滌。用80 μl洗滌緩沖液懸浮免疫磁珠復(fù)合物，均分為兩份，涂布于CT-SMAC，37℃培養(yǎng)18～20 h。乳白色可疑菌落接種于Chromagar○　R O157瓊脂平板，37℃培養(yǎng)20 h。紫紅色菌落等分別接種在2支裝有2 ml PBS(pH 7.4)試管中，并分別加入MUG和G試紙條，37℃振蕩培養(yǎng)1～3 h，于365 nm紫外燈下觀察熒光。G試紙條熒光陽(yáng)性、MUG試紙條熒光陰性的菌落進(jìn)行抗O157血清凝集試驗(yàn)。O157陽(yáng)性菌落用Vitek自動(dòng)生化檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行生化檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)。

　　4.PCR檢測(cè)VT(verotoxin)基因：挑O157陽(yáng)性菌落于裝有100～200 μl雙蒸水的Eppendorf管中，煮沸提取DNA模板。PCR反應(yīng)體系由200 μmol/L dTNPs、200 pmol MK1(5′-TTTACGAT
AGACTTCTCGAC-3′)和MK2(5′-CACATATAAATTATTTCGCTC-3′)、1×PCR緩沖液(50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Tris-HCl,pH8.3)和5 μl模板DNA組成。用10～20 μl石蠟油封蓋PCR反應(yīng)體系。94℃變性5 min后，加2.0 U的Taq酶于管底部，混勻。95℃變性30 s、47℃退火1 min、72℃延伸1.5 min，循環(huán)擴(kuò)增35次。循環(huán)結(jié)束后，于72℃延伸10 min，4℃保存。用含有溴化乙錠的2% agarose凝膠，在TAE緩沖液中電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

　　二、結(jié)果

　　1.標(biāo)本中E.coli O157的帶菌率：103份牛肉中，4份檢出E.coli O157，帶菌率為3.9%。其他樣品未分離到陽(yáng)性菌。

　　2.E.coli O157分離株VT基因的檢測(cè)：分離出的4株O157經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)，VT基因陽(yáng)性，其條帶為224 bp。

　　3.E.coli O157分離株的生化特征：Vitek自動(dòng)生化儀檢測(cè)4株E.coli O157，3株為尿素陽(yáng)性，1株為尿素陰性，而其他生化指標(biāo)符合O157的特征。O157分離株的MUG試紙條試驗(yàn)陰性，G試紙條試驗(yàn)陽(yáng)性。

　　三、討論

　　用本所建立的一套快速檢測(cè)E.coli O157的方法從上海地區(qū)牛肉中分離到4株E.coli O157，菌株帶VT基因。首次證實(shí)上海地區(qū)存在O157散發(fā)菌株，牛肉帶菌率與國(guó)外近似，或稍低于同類食品的帶菌率［1-3］。未在豬肉、羊肉、牛奶和污水檢樣中分離到E.coli O157。

　　在133份兒童腹瀉患者糞便中未分離到E.coli O157，這可能是由于：(1)檢測(cè)糞便樣本數(shù)還不夠大；(2)在腹瀉發(fā)病開始階段，就服用了抗生素，糞便中殘留的抗生素可能影響了E.coli O157；(3)我國(guó)居民飲食習(xí)慣為吃熟食，與國(guó)外不同。

　　E.coli的尿素酶一般是陰性，亦可發(fā)生變異。Hayes等［4］人報(bào)道了一株尿素酶呈陽(yáng)性的E.coli O157(G501)。本次分離的4株E.coli O157，3株為尿素酶陽(yáng)性，結(jié)果與其他報(bào)道一致。

作者單位：盧林耿（上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室　200032）
俞順章（上海醫(yī)科大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所）
張幼辰（上海醫(yī)科大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所）
衛(wèi)國(guó)榮（上海醫(yī)科大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所）

參考文獻(xiàn)

1，Armstrong GL,Hollingsworth J, Morris Jr JG,et al. Emerging foodborne pathogens:Escherichia coli O157∶H7 as a model of entry of a new pathogen in to the food supply of the developed world.Epidemiol Rev,1996,18∶29-51.
2，Blanco JE,Blanco M, Mora A, et al.Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7 in minced beef using immunomagnetic separation. Microbiol,1996,12∶385-394.
3，Radu S, Mutalib SA, Rusul G, et al. Detection of Escherichia coli O157∶H7 in the beef marketed in Malaysia. Appl Environ Microbiol,1998,64∶1153-1156.
4，Hayes PS,Blom K, Feng P,et al.Isolation and characterization of a β-D-glucuronidase-producing strain of Escherichia coli serotype O157∶H7 in the United State. J Clin Microbiol,1995,33∶3347-3348.