蛋白質經水解或酶解可由大分子變成小的pro成分，如水解后的產物經胨，肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構成pro最基本的物質。

水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化學結構以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評價食品的營養價值。

氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸（儀器價格昂貴，不能普遍使用），對于食品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中，所以需要測定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸態氮）的百分率表示，當然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計算出氨基酸的含量。

食品在評價蛋白質的營養價值時，除了測定pro的含量，氨基酸氮含量，還需要對各種氨基酸進行分離，鑒定，尤其對8種人體必需氨基酸進行定量定性分析。

一．單指示劑甲醛滴定法：

1原理：氨基酸具有酸，堿兩重性質，因為氨基酸含有-COOH基，而-COOH基顯示酸性，又含有-NH₂，-NH₂則顯示堿性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成為中性的內鹽，當加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結合，其堿性消失，破壞內鹽的存在，就可用堿來滴定-COOH基，以間接方法測定氨基酸的量，反應式以三種形式存在。

用堿完全中和-COOH基時的PH值為8.4~9.2。

2試劑：

（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1N NaOH溶液中和（淡蘭色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。

（3）0.100N  NaOH標準溶液。

3操作步驟：

稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯中（如為固體樣加水50ml）→加兩滴指示劑→用0.1N NaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時蘭色應消失→再用0.1N NaOH溶液滴定淡蘭色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數。

計算：氨基酸態氮=（N×V×0.014×100）/W×100

二．雙指示劑甲醛滴定法

1原理：

與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑，從分析結果看，雙指示劑甲醛滴定法與

亞硝酸氮氣容量法（此法操作復雜，但準確，不作介紹）相近，單色滴定法稍偏低，主要

因為單指示劑甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作為中性紅的終點，PH值為7.0，從理論計

算看，雙色滴定法比單色滴定法準確。

2試劑：同單指示劑一樣，多一個0.1%中性紅（50%乙醇溶液）

3操作步驟：

取相同兩份樣品→分別于100ml三角瓶→一份加中性紅2滴→用0.1N  NaOH滴定終點（由紅

變琥珀色），記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→搖勻→用0.1N 

NaOH 滴至淡蘭色。

計算：

氨基酸態氮=（N×（V2-V1）×0.014×100）/W×100

V1——用中性紅為指示劑時，堿液所消耗的體積

V2——用百里酚酞乙醇液為指示劑時標液消耗量

0.014——氮的毫克當量濃度

注意事項：

（1）單色指示劑甲醛滴定法，用堿完全中和—COOH基時的pH為8.5—9.5

（2）測定樣品的顏色較深，應加活性炭脫色之后再滴定

三．茚三酮比色法：

1原理：氨基酸在一定pH范圍內，能與茚三酮生成蘭紫色化合物。可以用比色法定量測定。

2試劑：

（1）磷酸緩沖液（pH.8.04）制備方法如下：

稱磷酸二氫鉀4.5350g。定容500ml

稱NAH₂PO₄·12H₂O   11.9380g分別溶解定容500ml

取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液

（2）2%茚三酮溶液：

稱茚三酮1g→溶于35ml熱水→加入40mg氯化亞錫（SnCl₂·H₂O）攪拌過濾（作防腐劑）→

于冷暗處過夜→定容50ml

①  氨基酸標液

稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→搖勻→吸10ml于另外100ml容量瓶

定容100ml，即得200Ug/ml標液

3操作方法：

（1）繪制標準曲線：

取7個25ml容量瓶，吸取標液 0   0.5   1.0   1.5   2.0   2.5   3.0ml于7個25ml容量瓶，加水補充

至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置

15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標準曲線。

（2）樣品測定：

取樣品5.00~10.0g（液體樣5-10ml）→于燒杯中→加50ml水和活性碳約5g→加熱過濾→用

30—40ml熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，

冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計算氨基酸含量。

氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100

C——從標準曲線上查得得氨基酸的量（Ug）

W——測定得樣品溶液相當于樣品的量（g）

注意事項：

茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進行純

化，方法如下：、

取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中

過濾，即出現蘭色結晶，過濾，用2ml冷水洗滌結晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。

思考題：

1 試述蛋白質測定中，樣品消化過程所必須注意的事項，消化過程中內容物顏色發生什么變化？為什么？

2 樣品經消化進行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時溶液發生什么變化？為什么？如果沒有變化，說明什么問題？須采用什么措施？

3 硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什么作用？
4 試述氨基酸態氮的測定原理。·

5 結果計算中為什么要乘上蛋白質系數？

實驗：①水果中酸度的測定。

            ②糕點中和脂肪的測定。