在制備液相流動相時，最讓人頭疼的一件事莫過于配緩沖鹽和調(diào)pH了，但是這確實準確配制流動相的關(guān)鍵，今天就和大家一起看看準確配備流動相的緩沖溶液的原則和需要注意的事項。

緩沖溶液是指由弱酸及其共軛堿（或弱堿及其共軛酸）所組成的緩沖對配制的，且能夠在加入少量強酸或強堿時，可以有效減緩pH值改變的水溶液。緩沖溶液能幫助維持分析方法的穩(wěn)定，而不會因為微弱的環(huán)境改變的情況下而造成分析結(jié)果的改變。

緩沖溶液是被用來維持pH值的穩(wěn)定。它們是通過維持弱酸及其共軛堿的平衡從而防止了pH值的改變。

緩沖溶液是如何工作的？

根據(jù)Le Chatelier原理，當一些強酸 (或者更多的氫離子“H+”) 加入到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時，平衡會被向左移動。同樣，如果在混合物中加入強堿，氫離子濃度下降的幅度會小于所預期加入堿的量。

當配制緩沖溶液時

你應(yīng)該遵循以下幾個原則


在配制緩沖液前，建議用定值校準緩沖液標準品來校對電子pH計
根據(jù)所需緩沖液的濃度，精確地稱出所需緩沖鹽的重量
把所需的緩沖鹽加到已經(jīng)裝有HPLC色譜級超純水的容量燒瓶中，并充分攪拌至完全溶解
使用pH探針或pH計去測量溶液的pH值
通過添加少量的強酸或強堿，將容液的pH值調(diào)整至所需的值
調(diào)整至所需pH值后，將溶液用色譜級超純水稀釋至最終的所需體積容量，并混合均勻
HPLC緩沖液通常用于控制在液相色譜分析中所不希望出現(xiàn)的二次相互作用。此外，緩沖液也被用來工作分析物的電離狀態(tài)，以確保分析物不會同時出現(xiàn)一個以上的電離狀態(tài)。

化合物的pKa值代表此化合物的50%離子化和50%中性時的pH值。如果在此pH值下分析此化合物，你會看到分裂峰的出現(xiàn)或者不穩(wěn)定的保留時間。因此，我們建議所有的分析方法的pH值都應(yīng)該控制在目標分析化合物的pKa值正負兩個pH單位以上。

當配制等度流動相的時候，我們

還需要考慮以下幾個因素來確保方法的穩(wěn)定

盡可能提前預混合你所使用的流動相，因為這將防止經(jīng)過泵混合流動相時會出現(xiàn)的錯誤
每一次都需要始終使用相同的配制方法及流程。例如，如果你方法是先加水，那你每次都必須是先加水。如果你是先測定單獨的成分然后再混合，那你就必須每次都按這個流程來做。記得千萬不要改變這一個固定的配制流程，因為這個配制流程的改變讓分析物的保留時間可能出現(xiàn)很大的改變


以下的這個實驗例子展示了當流動相

用以下不同的方式來混合時，

峰保留時間可能出現(xiàn)的改變

方法一

先加水：先用量筒量400毫升的水并倒進1升的容量瓶中，然后用甲醇稀釋至容量瓶的刻度

方法二

先加甲醇：先用量筒量600毫升的甲醇并倒進1升的容量瓶中，然后用水稀釋至容量瓶的刻度

方法三

甲醇和水各自先量好：先用量筒量600毫升的甲醇并倒進流動相瓶中，然后用同樣的量筒量400毫升的水并倒進已經(jīng)裝有甲醇的流動相瓶中

方法四

讓液相的泵來混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇

緩沖液的濃度也是很重要的。我們一般認為，10mM以下的濃度不足夠提供可以控制化合物硅醇活性或者電離狀態(tài)所需要的緩沖能力，因此10mM是反相或者HILIC色譜模式下的最低有效濃度。對于其他色譜模式，如體積排阻色譜就需要更高的緩沖液濃度，使用超過100mM濃度的緩沖液在體積排阻色譜法中并不罕見。

緩沖液的濃度必須非常精確地平衡好，以確保在所有的條件下都能達到完全溶解。在反相條件下，如果方法條件是包含了高比例有機相的話（例如跨度很大的梯度），則很有可能需要控制緩沖液的濃度，以確保不會出現(xiàn)緩沖鹽的析出。

當開發(fā)一個可靠穩(wěn)定的HPLC方法時，流動相的貢獻跟色譜柱固定相的選擇性一樣重要，另外流動相的選擇與配制跟色譜柱固定相批次間的質(zhì)檢也是一樣重要的。
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