一、器材與試劑： 

干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

具體步驟：

（1）水的制備：

細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.

（2）PBS的制備與消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制）：

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。

（3） 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：

胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+ 、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+ 、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。

 

培養(yǎng)用液的配制與消毒1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過夜。

2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

（4）青、鏈霉素溶液的配制于消毒

1.所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。

2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。

3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克

（5）RPMI1640的制備與消毒：

1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基中）,充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。

4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。

（6）血清的滅活：

細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

（7）HEPES溶液：

HEPES的化學全稱位羥 （N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。

1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：

準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。

注意：因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

 

培養(yǎng)用液的配制與消毒（8）谷氨酰胺：

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。

一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

（9）肝素溶液的配制：

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為­­ ℃ 。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。

（10） Ⅰ型膠原酶：

0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

（11）明膠溶液：

因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0.1%的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

（12）其他培養(yǎng)用液的配制：

20ug/ml內(nèi)皮生長因子，

注意事項：

1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2，可在配制時調(diào)PH至7.4。