淋巴細胞培養 (Lymphocyte culture) 正常成熟的淋巴細胞不經特殊處理不能在體外傳代培養。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續傳代，這是病毒轉化細胞的例證，也是分離出EBV的標志。T淋巴細胞在加入T細胞生長因子(IL-2)后可在體外培養，為研究人類逆轉錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件，HIV在T淋巴細胞培養 物中增殖形成多核巨細胞。

2.動物試驗 這是最原始的病毒分離培養方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據各病毒對組織的親嗜性而定，可接種鼻內、皮內、腦內、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內，柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內。接種后逐日觀察實驗動物發病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續傳代，并作鑒定。

3.雞胚培養 用受精孵化的活雞胚培養病毒比用動物更加經濟簡便。根據病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內或靜脈內，如有病毒增殖，則雞胚發生異常變化或羊水、尿囊液出現紅細胞凝集現象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養；但很多病毒在雞胚中不生長。

(二)分離病毒的鑒定

1.病毒在細胞內增殖的指征

(1)細胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在細胞內增殖引起細胞退形性變，表現為細胞皺縮、變圓、出現空泡、死亡和脫落。某些病毒產生特征性CPE，普通光學倒置顯微鏡下可觀察上述細胞病變，結合臨床表現可做出預測性診斷(表80-4)。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優點，細胞內的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

表80-4 病毒在細胞內增殖的指征

(2)紅細胞吸附現象(Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24-48小時，以細胞膜上出現病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞，發生紅細胞吸附現象。若加入相應的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現象的發生，稱為紅細胞吸附抑制試驗。這一現象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。

(3)干擾現象 (Interference phenomenon) 一種病毒感染細胞后可以干擾另一種病毒在該細胞中的增殖，這種現象叫干擾現象。前者為不產生CPE的病毒(如風疹病毒)但能干擾以后進入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使后者進入宿主細胞不再生產CPE。

2.病毒感染性的定量測定

空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU) 測定 這是一種測定病毒感染性比較準確的方法。將適當濃度的病毒懸液接種到生長單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中，當病毒吸附于細胞上后，再在其上復蓋一層溶化的半固體營養瓊脂層，待凝固后，孵育培養。當病毒在細胞內復制增殖后，每一個感染性病 毒顆粒在單層細胞中產生一個局限性的感染細胞病灶，病灶逐漸擴大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”，清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來表示。

(2)50%致死量(LD50)或50%組織細胞感染量(TCID50)的測定 本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動物或組織培養后，引起50%發生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續稀釋，接種于上述雞胚，易感動物或組織培養中，經一定時間后，觀察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發病而死亡等，經統計學方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量，可獲得比較準確的病毒感染性滴度。

3.病毒形態與結構的觀察 病毒懸液經高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據大小、形態可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學技術分析病毒核酸組成、基因組 織構、序列同源性比較加以鑒定。

4.血清學鑒定 用已知的診斷血清來鑒定。補體結合試驗可鑒定病毒科屬；中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應結合臨床癥狀，檢材來源及流行季節等加以綜合分析，并應注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復期雙份血清作血清學試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。

三、病毒核酸及抗原的直接檢出

(一)直接檢出病毒核酸

1.核酸雜交(Nucleic acid hybridization) -臨床病毒學中報速診斷方法通常是檢測標本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點雜交 (Dot hybridization) 廣泛用于檢測呼吸道標本，尿標本中的病毒核酸。標本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結合到膜上，在原位進行鹼變性處理后，有放射標記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補原則結合成雙股，經放射自顯影，陽性結果出現斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標本經熱變性處理，點到膜上，使用輪狀病毒體外轉錄的放射標記探針做斑點雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補的DNA探針做斑點雜交。

目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病 人標本中的病毒DNA，也用于檢測不易分離培養的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標本中的病毒DNA。

2.多聚酶鏈反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴增法。先將待檢標本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3�端引物向5�端延伸DNA鏈，經20～40個循環，可使1個拷貝的核酸擴增至106以上，經瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養及含量極少的病毒標本，有較大應用前景。

(二)直接檢測病毒抗原

1.免疫熒光(IF)技術 如前所述IF可用于細胞培養 病毒的鑒定，也適用檢測臨床標本中病毒抗原，具有快速、特異的優點。直接免疫熒光技術是用熒光素直接標記特異性抗體，檢測病毒抗原；間接免疫熒光技術是先用特異性抗體與標本中抗原結合，再用熒光素標記的抗體與特異性抗體結合，從而間接識別抗原。可取咽喉脫落細胞，檢測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或腦活檢標本，檢測單純皰疹病毒抗原；取尿沉渣檢測巨細胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測的靈敏度和準確性。

2.免疫酶法(IEA) 原理與應用范圍同免疫熒光技術，IEA是用酶(通常是過氧化物酶)取代熒光素標記抗體，酶催化底物形成有色產物，在普通光學顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。

3.放射免疫測定法(RIA) 有競爭RIA和因相RNA二種方法。競急RIA是同位素標記的已知抗原與標本中未標記的待檢抗原競爭性結合特異性抗體的試驗，將形成的復合物分離出來，用放射免疫檢測儀測定放射活性，同時與系列稀釋的標準抗原測定結果進行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標本中的抗原，然后加入放射性標記的特異性抗體與抗原結合，測定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

4.酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標本中相應抗原，然后加入酶標特異性抗體，相應抗原被夾在抗體之間，當加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質，已被多數實驗室采用。

此外，對難以分離培養，形態特殊且病毒數量較多的標本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。

四、特異性抗體的檢測特異性抗體的檢測

病毒感染后通常誘發針對病毒一種或多種抗原免疫應答，特異性抗體效價升高或lgM抗體出現有輔助臨床診斷的價值。

(一)補體結合試驗(CF) CF分二個階段：1.抗原與抗體(一個為已知，一個為待檢)混合，加入定量補體，若抗原與抗體相對應，則補體被消耗；2.在上述混合物中加入溶血素致敏的綿羊紅細胞，若補本已與抗原抗體復合物完全結合，沒有剩補體存在，那么綿羊紅細胞不會溶血，結果為陽性，說明待檢標本中有特異性存在，出現陽性結果時血清標本最高稀釋度為抗體的效價。反之為陰性結果。由于補體結合抗體產生早，消失快，適于診斷病毒近期感染。(表80-5)。

*此例的抗體效價升高4倍，有診斷意義。

(二)中和試驗(NT) 在活體或活細胞內測定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗。試驗時：①須先測出病毒的半數致死量(LD50)或半數感染量(ID50)；②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合，放置1～2小時讓其充分中和；③將病毒與血清混合液注入各組動物、雞胚或組織細胞培養管內培養；④根據動物、雞胚死亡數或細胞病變的管數，計算出百分比(%)，然后再計算這些試驗對象中的半數免于死亡或免于致病所需要的最少量血清(或最大量的病毒)，就是該血清的中和抗體效價(稱為50%終點的中和效價)。診斷病毒性疾病時，須取病人雙份血清同時做對比試驗，病后血清的中和抗體效價也必須超過病初血清4倍以上，才能確診(表23-6)。用此法鑒定病毒時，須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清(對照)混合做對比試驗，免疫血清比正常血清多中和50～100倍劑量的病毒，才能斷定是該病毒。、

表80-6 病人雙份血清的病毒中和試驗結果(組織細胞培養的中和試驗)

說明：
①TCID50=組織培養半數感染劑量。

②每種稀釋度接種4支組織細胞培養管；0=未出現細胞致病作用；+=出現細胞致病作用。

③此例的病后血清中和抗體效價比病初血清增高8倍，有診斷意義。

病毒中和抗體的特異性高，持續時間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長期存在中和抗體，所以適用于流行病學調查或人群免疫水平研究，但因試驗方法繁雜，耗用動物、雞胚或細胞培養較多，故一般不作常規使用。

(三)血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition test,HIT)某些病毒(流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等)能凝集紅細胞，而抗體與這些病毒結合后卻能阻止它們的凝集，若雙份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于診斷這類病毒感染。本法簡便、快速、經濟、特異性高，常用于流行病學調查等。

(四)lgM捕捉ELISA 特異性lgM出現于病毒感染的早期或病毒感染的活動期，因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM，這是病毒感染實驗室早期診斷的可靠方法。實驗中先用u鏈血清包被微培板孔，用以捕捉血清標本中的lgM類抗體，再加入特異性病 毒抗原及酶標抗體以證實特異性lgM的存在。現已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中，lgM檢測有特殊意義，因lgM不能通過胎盤，新生兒血清中發現抗病毒lgM提示為宮內感染。