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大腸桿菌O157:H7的檢驗

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-09-01
核心提示:出血性大腸桿菌O157:H7介紹 1、培養(yǎng)基制備:  改良EC新生霉素增菌肉湯 (mEC): EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過濾除菌的新生

出血性大腸桿菌O157:H7介紹

1、培養(yǎng)基制備:

  改良EC新生霉素增菌肉湯 (mEC) EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過濾除菌的新生霉素,使終濃度為20μg/mL。

  改良山梨醇麥康凱瓊脂(TC-SMAC):山梨醇麥康凱瓊脂加入過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液,使終濃度2.5mg/L,頭孢克污,使終濃度為0.05mg/L。
MUG-LST肉湯:LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG),使終濃度為0.1g/L。

2、增菌培養(yǎng)

  秤取25克樣品放入225mL mEC中,均質。于41±1℃培養(yǎng)18-24小時。

3、分離

  將mEC肉湯培養(yǎng)物10倍遞增稀釋。從10-4,10-5,10-6稀釋度,各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培養(yǎng)18~24小時。

  可疑 EHEC O157:H7菌落扁平,透明或半透明,邊緣光滑,呈淡褐色中心,直徑約2mm。

  附:在梅里埃公司改良山梨醇麥康凱瓊脂上的菌落。

4、鑒定

  挑取TC-SMAC上的可疑菌落,接種MUG-LST,于36±1℃培養(yǎng)18~24小時,出現(xiàn)產氣,且無熒光者,分離到普通營養(yǎng)瓊脂。

  對純菌落用EHEC O157:H7標準血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗,必要時進行生化試驗。

  在檢測過程中,也可以在選擇性增菌后,取出5mL增菌液,經(jīng)100℃水浴15分鐘滅活后,供自動酶聯(lián)熒光免疫測試(VIDAS),迅速獲得初步結果,陽性反應者需作進一步證實。

  附:自動酶聯(lián)熒光免疫測試(mini-VIDAS)

    自動酶聯(lián)熒光免疫測試(VIDAS)測定程序

  •   EHEC O157:H7檢驗程序圖解

檢樣25g

      mEC225mL → VIDAS快速篩選

  ↓41±1℃,18-24h

10-4,10-5,10-6稀釋度涂布TC-SMAC

↓36±1℃,18-24h

挑取5-10個可疑菌落接種MUG-LST

↓36±1℃,18-24h

MUG陰性培養(yǎng)物轉種普通營養(yǎng)瓊脂

↓     ↓

生化反應鑒定    血清凝集鑒定

       或

         膠乳凝集試驗

  用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落,經(jīng)抗E.coli O157:H7標準血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽性者,報告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。

  如需要進一步檢測Vero毒素基因的存在,可通過接種Vero細胞或Hela細胞,觀察細胞病變進行判定,或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應(PCR)檢測法。(參見FDA細菌分析手冊第8版)

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關鍵詞: 大腸桿菌
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