實驗室中常用的是以硅膠和氧化鋁做固定相的吸附柱。硅膠層析法的分離原理是根據物質在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較弱的物質不易被硅膠吸附， 整個層析過程即是吸附、 解吸、 再吸附、 再解吸過程。

雖然很多化學實驗書中都敘述了柱層析的實驗方法，但大多數都是比較雷同地泛泛地描述，而且有些描述在實驗室中并不適用。

例如， 很多書中都提到裝柱時先在底層鋪一層石英砂， 倒入固定相后再在頂部鋪一層石英砂。比較繁瑣， 而且效果也不是很好，在實驗室中不適用。

根據多年來使用柱層析的操作經驗，本文總結了在使用柱層析時的幾個技巧：

1、 硅膠的使用

初做柱層析很容易把柱子裝得長了或短了，有時還會有大量的硅膠剩余，浪費硅膠，這主要是對硅膠等固定相的使用的量沒有掌握。柱層析用的硅膠一般是 100-200 目，100 毫升硅膠的質量在47 克左右，如果裝一個直徑是 2.8 厘米的柱子，可以裝 18 厘高。

為了避免浪費硅膠和溶劑，最初學習裝柱時最好對實驗室中各種不同規格的柱子摸摸底。方法很簡單：用量筒量出 100 毫升干硅膠， 直接倒入各種規格的柱子中，敲實，用刻度尺量出硅膠在柱子中的高度，這樣就可以做到心中有數了。

一般在裝柱的時候可以根據實驗所需柱子的高度來調整硅膠的使用量，這樣就可以大大地節省硅膠的使用，避免造成沒有必要的浪費。稱量硅膠時一般稱30~70倍于上樣量， 如果極難分， 也可以用100 倍量以上的硅膠。

2、 洗脫劑的使用

洗脫劑的極性可用薄層層析來確定，一般以待分離樣品 Rf 值為 0.2-0.3 為宜。選擇的洗脫劑應該使兩相鄰物質 Rf 值之差最大化。不要認為在板上爬得高分離的效果就比較好，如果 Rf 在 0.6，即使相差 0.2 也不容易在柱子上分開，因為柱子是一個多次爬板的過程，可以通過公式的比較：0.6/0.8 一次的分離度，肯定不如（0.2/0.3） 的三次方或四次方大。

有時雖然在薄層板上看到分離的效果很好，但過柱層析時還是很難分開。這主要的原因就是薄層層析用硅膠比柱層析用硅膠要細得多，所以分離效果好。

解決的辦法就是降低洗脫劑的極性，一般柱層析用洗脫劑比薄層層析用的展開劑極性要再降低一倍可以達到比較好的分離效果。當所分離物質極性跨度較大時， 可用采梯度洗脫的方法， 即逐漸增加溶劑的極性，使吸附在硅膠上的不同化合物逐個洗脫下來。

常用的展開劑極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統；極性較大的用甲醇：氯仿系統；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。對于很難分離的化合物，一是增加柱子的長度和直徑，二是減小洗脫劑的極性，這樣可以很好地將混合物分開。

在同樣能洗脫的情況下，盡量使用毒性小的洗脫劑。例如，乙酸乙酯：石油醚系統和二氯甲烷：石油醚系統， 在同樣都能洗脫的情況下，應該用毒性小的乙酸乙酯：石油醚系統。

另外洗脫劑在過柱子后最好也回收使用，一方面環保，另一方面也能節省部分經費，缺點是要消耗一定的人工。

這里要注意的是，一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸，混合溶劑的比例由于揮發度的不同會導致極性的變化， 一般會使得極性變大，在梯度淋洗時比較合適。還有一般回收的溶劑中會有少量水分，使用前先要用干燥劑干燥好才能使用。

3、 裝柱子的技巧

柱層析的裝柱非常重要，裝柱的效果會直接影響層析分離效果。有濕法裝柱和干法裝柱等兩種方法。濕法裝柱很簡單，使用也最普遍， 就是先用比固定相多一倍的洗脫劑將固定相活成勻漿，柱子底部先用脫脂棉塞緊， 然后倒入洗脫劑將脫脂棉中氣泡趕出。

用漏斗將活好的固定相倒入柱子中， 打開底部活塞， 將柱子中高出固定相的溶劑放出。期間不斷用橡皮棒敲打， 將固定相敲實， 做到密實均勻無氣泡即可。

很多時候用加壓的方法可以很高效地裝好柱子，而且在柱子中沒有氣泡產生。

干法裝柱與濕法裝柱剛好相反的是，它是將干燥的吸附劑從柱子上端直接加入到一個空的柱子中， 然后用油泵抽柱子底部， 相當于減壓過柱， 直到柱子變得很結實， 再用淋洗劑“走柱子” 。

干法裝柱的一個缺點就是在裝入洗脫劑后， 由于溶劑和固定相之間的吸附放熱， 所以柱子容易變花，影響分離效果。

解決的方法是：

（1）固定相一定要添加結實；

（2）一定要用較多的溶劑“走柱子”，直到柱子的下端不再發燙， 恢復到室溫后再撤去壓力。無論使用哪種方法裝柱，最后都要求所裝的柱子結實、勻稱、無氣泡。

4、 上樣的技巧

上樣也有濕法和干法之分：濕法一般用淋洗劑溶解樣品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等， 但溶劑越少越好。再用膠頭滴管轉移得到的溶液，沿著層析柱內壁緩慢地均勻加入。

在不用海沙的情況下， 盡量不要破壞硅膠面。加樣后， 打開柱底活塞， 讓固定相充分地吸附所加樣品。然后再加入一些洗脫劑，再充分地吸附后將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。

然后就可以放心地加入大量洗脫劑， 而不會沖壞硅膠表面。很多樣品在上柱前是粘乎乎的， 一般沒關系。有的時候上樣后在硅膠上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現， 是因為硅膠對樣品的吸附飽和， 而樣品本身又是比較好的固體才會析出， 這就需要先重結晶樣品， 得到大部分的產品后剩余的產品再柱分。

如果不能重結晶也沒關系，直接過柱就行， 樣品會隨著淋洗劑流動而慢慢溶解， 最后隨著洗脫劑流出。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如 DMF，DMSO等， 會隨著溶劑一起走， 顯色是一個很長的脫尾） ， 這時就必須用干法上柱了。

 干法過柱是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠， 拌勻后再旋去溶劑。一般樣品和硅膠按 1：1 的量混合， 硅膠使用的量也可以少一些， 但是要保證在旋干后， 不能看到明顯的固體顆粒，讓樣品都吸附在硅膠的表面上。然后小心地加入到裝好的柱子中， 加入洗脫劑洗脫。

5、 過柱的技巧

柱層析按過柱時的壓力可以分為：加壓， 常壓， 減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度， 減少產品收集的時間， 但是會減低柱子的塔板數。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的， 但是時間也最長， 例如一些天然化合物的分離，有時一個柱子過幾個月也有可能。

減壓柱能夠減少硅膠的使用量，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發， 有時會在柱子外面有水汽凝結， 另外有些比較易分解的東西可能得不到， 而且還必須同時使用水泵抽氣， 噪音大， 時間長， 所以減壓過柱用得比較少。

加壓過柱是一種比較好的方法， 與常壓柱類似， 但用外加壓力可以使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵 （用魚缸供氣的加壓泵就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中很適用。

一般壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。因為加壓過柱效率高， 分離效果較好， 所以加壓過柱在普通的有機化合物的分離中是非常適用的。

一些低沸點溶劑裝柱時往往會在柱子中產生氣泡， 使柱子變花， 利用加壓過柱法在裝柱時就可以有效地解決這個問題， 而且可以使柱子很快裝實。

隨著科技的發展， 色譜法的技術也日新月異， 但柱層析實驗技術還是比較簡單和實用的， 每個科研工作者在使用柱層析時， 可以根據自己的實際情況來不斷地摸索，不斷地總結和提高柱層析的實驗技術。