由于微生物細胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細胞的運動性和直接計算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進行觀察。但是，任何一項技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細胞的真實情況，染色觀察時必須注意。

　　本節(jié)包括四部分：
一、染色的基本原理
二、染料的種類和選擇
三、制片和染色的基本程序
四、染色方法

一、染色的基本原理

　　微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質(zhì)對染料的毛細現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學因素則是根據(jù)細胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學反應。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細胞核對于堿性染料就有化學親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。

　　細菌的等電點較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細菌常和帶陽電的堿性染料進行結(jié)合。所以，在細菌學上常用堿性染料進行染色。

　　影響染色的其它因素，還有菌體細胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色。

二、染料的種類和選擇

　　染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分復雜，有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。

　　染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料、中性（復合）染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?/p>

1、酸性染料

　　這類染料電離后染料離子帶負電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。

2、堿性染料

　　這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細菌易被堿性染料染色。

3、中性（復合）染料

　　酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細胞核的染色。

4、單純?nèi)玖?/p>

　　這類染料的化學親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。　　

三、制片和染色的基本程序

　　微生物的染色方法很多，各種方法應用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。

1、制片

　　在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。

2、自然干燥

　　涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。

3、固定

　　標本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：

　　１）殺死微生物，固定細胞結(jié)構(gòu)。

　　２）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。

　　３）改變?nèi)玖蠈�細胞的通透性，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。

　　固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標本的遠端），標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。

　　以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應用較多普遍，但是應當指出，在研究微生物細胞結(jié)構(gòu)時不適用，應采用化學固定法。化學固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用。應用餓酸固定細胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細管，在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過1—2分鐘后把標本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。

4、染色

　　標本固定后，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標本與染料的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱。染料作用標本的時間平均約1—3分鐘，而所有的染色時間內(nèi)，整個涂片（或有標本的部分）應該浸在染料之中。

　　若作復合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時進行。

５、脫色

　　用醇類或酸類處理染色的細胞，使之脫色。可檢查染料與細胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。

６、復染

　　脫色后再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復紅最后進行染色，就是復染。

７、水洗

　　染色到一定的時候，用細小的水流從標本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

８、干燥

　　著色標本洗凈后，將標本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。

９、鏡檢

　　干燥后的標本可用顯微鏡觀察。

　　綜上所述，染色的基本程序如下：

　　制片→固定→媒染→染色→脫色→復染→水洗→干燥→鏡檢。

四、染色方法

　　微生物染色方法一般分為單染色法和復染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。

１、單染色法

　　用一種染色劑對涂片進行染色，簡便易行，適于進行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細菌菌體多帶負電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強酸性（低于細菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。

　　單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。

　　染色結(jié)果依染料不同而不同：

　　石碳酸復紅染色液：著色快，時間短，菌體呈紅色。　　

　　美蘭染色液：著色慢，時間長，效果清晰，菌體呈蘭色。

　　草酸銨結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。

２、革蘭氏染色法

　　革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

　　細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負反應。

　　革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應不一樣。現(xiàn)在一般認為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結(jié)晶紫的復合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應的主要依據(jù)。

　　另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結(jié)晶紫—碘復合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應嚴格控制。

　　革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

　　１）涂片固定。

　　２）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。

　　３）自來水沖洗。

　　４）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

　　５）水洗，用吸水紙吸去水分。

　　６）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分。

　　７）蕃紅梁色液（稀）染10秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

　　染色的結(jié)果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。