顯微技術是微生物檢驗技術中最常用的技術之一。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗中最常用的還是普通光學顯微鏡。　　

一、普通光學顯微鏡的結構和基本原理：

1.結構：

　　光學顯微鏡是由光學放大系統和機械裝置兩部分組成。光學系統一般包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等；機械系統一般包括鏡筒、物鏡轉換器、鏡臺、鏡臂和底座等。（圖３－１）

　　標本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數越大，它的焦距越短。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。油鏡的工作距離很短，使用時需格外注意。目鏡只起放大作用，不能提高分辨率，標準目鏡的放大倍數是十倍。聚光鏡能使光線照射標本后進入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱，因而對提高物鏡分辨率是很重要的。聚光鏡可以上下移動，以調節光的明暗，可變光闌可以調節入射光束的大小。

　　顯微鏡用光源，自然光和燈光都可以，以燈光較好，因光色和強度都容易控制。一般的顯微鏡可用普通的燈光，質量高的顯微鏡要用顯微鏡燈，才能充分發揮其性能。有些需要很強照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素燈作為光源。

　圖３－１　光學顯微鏡結構圖

2.原理：

　　顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數值口徑決定，縮短使用的光波波長或增加數值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學顯微鏡分辨率是有限的，提高數值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數值口徑，可以提高介質折射率，當空氣為介質時折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52）相近，這樣光線可以不發生折射而直接通過載片、香柏油進入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數是目鏡和物鏡放大倍數的乘積，而物鏡的放大倍數越高，分辨率越高。

二、普通顯微鏡的使用方法

1、低倍鏡觀察

　　先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標本片，轉動反光鏡，調好光線，將物鏡提高，向下調至看到標本，再用細調對準焦距進行觀察。除少數顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點。如果視野中出現外界物體的圖像，可以將聚光鏡稍微下降，圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應調到適當的大小，以控制射入光線的量，增加明暗差。

2、高倍鏡觀察

　　顯微鏡的設計一般是共焦點的。低倍鏡對準焦點后，轉換到高倍鏡基本上也對準焦點，只要稍微轉動微調即可。有些簡易的顯微鏡不是共焦點，或者是由于物鏡的更換而達不到共焦點，就要采取將高倍物鏡下移，再向上調準焦點的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。稍微上下移動聚光鏡，觀察圖像是否清晰。

3、油浸鏡觀察

　　油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時，一般是經低倍、高倍到油浸鏡。當高倍物鏡對準標本后，再加油浸鏡觀察。載玻片標本也可以不經過低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調向上調準焦點。沒有自動止降裝置的，對準焦點的方法是從顯微鏡的側面觀察，將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微調向上提升調準焦點。

　　使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流動。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會降低數值口徑而影響分辨率。無論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調節的顯微鏡燈作光源。

三、普通顯微鏡的保養

　　顯微鏡是精密貴重的儀器，必須很好地保養。顯微鏡用完后要放回原來的鏡箱或鏡柜中，同時要注意下列事項：

1、觀察完后，移去觀察的載玻片標本。

2、用過油浸鏡的，應先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。

3、轉動物鏡轉換器，放在低倍鏡的位置。

4、將鏡身下降到最低位置，調節好鏡臺上標本移動器的位置，罩上防塵套。

　　鏡頭的保護最為重要。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙擦拭。擦鏡紙要放在紙盒中，以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。物鏡在必要時可以用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。根據不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團蘸取少量的二甲苯，輕擦，并立即用擦鏡紙將二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨。目鏡是否清潔可以在顯微鏡下檢視。轉動目鏡，如果視野中可以看到污點隨著轉動，則說明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡，擦過后用洗耳球將短絨吹去。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時，都要用擦鏡紙將鏡筒的口蓋好，以防灰塵進入鏡筒內，落在鏡筒下面的物鏡上。

四、顯微計數

　　利用血球計數器在顯微鏡下直接計數是一種常見的微生物計總數的方法。因為計數器載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據顯微鏡下觀察到的微生物數目來計算單位體積內微生物總數。

　　血球計數器是一只特制載玻片。載片上有兩個方格網，每一方格網共分九個大方格，其中間的一個大方格用來做微生物計數，所以又稱為計數室。計數室的刻度一般有兩種，一種是每個大方格分成16個中方格，每中方格又分成25個小方格。另一種是一個大方格分25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，不論哪一種，一個大方格，都等分成（25×16或16×25）400個小方格。（圖３－２）因為每個大方格邊長為1毫米，載片與蓋片間距離為0.1毫米，所以每個計數室（1個大方格）體積為0.1

　圖３－２　兩種血球計數板

a. 25X16計數板 b.16X25計數板

立方毫米。測出每個中方格菌數，就可以算出一個大方格的菌數，由此推算出1毫升菌液內所含的菌數。

　　一個大方格是16個中方格時，應當數4角4個中方格（即100個小方格）的菌數，一個大方格是25個中方格時，除取4角4個中方格外，還要數中央一個中方格（即為80個小方格）的菌數。

計算公式如下：

16×25計數板：

總菌數/ml=×400×10000×稀釋倍數

=每個小方格內菌數×4×10⁶×稀釋倍數

25×16計數板：

總菌數/ml=×400×10000×稀釋倍數

=每小方格內菌數×4×10⁶×稀釋倍數