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眾所周知，在反相液相色譜中，固定相是非極性的，而流動(dòng)相是極性的。我們?nèi)绾问沽鲃?dòng)相呈極性呢？通過(guò)添加水這樣的水性組分。然而，添加水的比例有限制，不能使用含水量過(guò)高的流動(dòng)相進(jìn)行反相液相色譜分析，如90%、95%甚至100%。那么，這是什么原因呢？
首先，我們需要了解為什么要使用高含水量的流動(dòng)相。原因可能是為了保留高極性分子，如有機(jī)酸。例如抗壞血酸，這些分子在性質(zhì)上是高極性的，它們?cè)诜聪嘁合嗌V中不會(huì)被充分保留，因?yàn)槲覀兊墓潭ㄏ嗍欠菢O性的，而非極性固定相不會(huì)保留這些極性化合物。因此，需要在流動(dòng)相中添加高比例的水相。這是因?yàn)樗且环N極性溶劑，它能夠與極性較強(qiáng)的分析物形成氫鍵或離子相互作用，從而降低分析物在流動(dòng)相中的溶解度，有利于分析物在色譜柱上的保留和分離。
接下來(lái)，我們需要了解C8或C18固定相的性質(zhì)。C8/C18是一種常用的反相液相色譜柱，其表面鍵合有C8或C18烷基鏈，具有類似油脂的非極性特性。在反相色譜法中，分析物在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行分配，以實(shí)現(xiàn)分離。由于C8/C18柱的固定相非極性，它們通常適用于分析非極性或弱極性分析物。然而，油水不能混合，類似油脂的非極性特性使得C8或C18固定相在高比例水相中不能被潤(rùn)濕。當(dāng)流動(dòng)相中有一定比例的有機(jī)溶劑，如乙腈或甲醇（其性質(zhì)為非極性）時(shí)，對(duì)C8或C18具有良好的潤(rùn)濕性。而鍵合的固定相是位于硅膠孔內(nèi)的，這意味流動(dòng)相能夠潤(rùn)濕C8或C18固定相的孔。這一點(diǎn)是非常重要的，否則它們將無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的保留。然而，如果使用100%的水相作為流動(dòng)相，這會(huì)使C8或C18鍵合固定相干涸。因?yàn)樗哂休^高的表面張力，流經(jīng)固定相的水分子不會(huì)進(jìn)入孔內(nèi)，而只會(huì)通過(guò)孔之間的空間。這樣一來(lái)，孔就不會(huì)打開，如果孔沒(méi)有被潤(rùn)濕，那么固定相無(wú)法處于活躍狀態(tài)，不能與分析物發(fā)生相互作用。這就是在反相液相色譜中使用C8/C18柱時(shí)要避免高水相流動(dòng)相的原因。
當(dāng)C8/C18固定相暴露在高水相流動(dòng)相中時(shí)，由于表面張力較高，C8/C18表面會(huì)脫水，這種現(xiàn)象稱為固定相塌陷、鏈折疊或固定相打結(jié)，化合物無(wú)法正常地與固定相發(fā)生相互作用進(jìn)行保留。
那么，固定相塌陷會(huì)帶來(lái)哪些問(wèn)題呢？固定相塌陷可能會(huì)導(dǎo)致保留減少、保留時(shí)間的不重復(fù)的現(xiàn)象。并且如果想再次從干涸狀態(tài)恢復(fù)到潤(rùn)濕狀態(tài)，這個(gè)反向過(guò)程將需要很長(zhǎng)的時(shí)間。保留的減少是因?yàn)殒I合固定相的活性表面存在于硅膠孔中，而孔內(nèi)沒(méi)有被潤(rùn)濕，化合物也無(wú)法進(jìn)入孔內(nèi)與其發(fā)生相互作用。因此，保留時(shí)間會(huì)減少。例如，如果使用90%的水和10%的甲醇作為流動(dòng)相，保留時(shí)間為10分鐘。此時(shí)，如果只使用100%的水，10分鐘的保留時(shí)間會(huì)急劇減少到3~4分鐘。第二個(gè)重要的點(diǎn)是保留時(shí)間的重復(fù)性會(huì)降低，可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而發(fā)生變化。所以，如果保留時(shí)間變化很大，可能是因?yàn)榱鲃?dòng)相中水含量較高。
如果別無(wú)選擇，只能使用水性或高比例水相的流動(dòng)相，那么在方法開發(fā)階段，需要注意選擇合適的色譜柱。
1.未封端色譜柱。未封端柱表面存在較多的具有一定極性的游離硅醇，游離硅醇使固定相表面能被潤(rùn)濕，有利于極性分析物的保留。
2.短鏈烷基色譜柱：鍵合鏈之間存在游離體積，硅醇的屏蔽作用很小，有利于極性分析物的分離。
3.極性嵌入烷基相色譜柱：在烷基鏈中嵌入極性基團(tuán)，增強(qiáng)與極性分析物之間的相互作用，提高保留性能。
4.寬孔徑相色譜柱：以便水可以滲透到孔內(nèi)使相濕潤(rùn)，有利于極性分析物在高水相流動(dòng)相下的保留。
綜上所述，在使用C8/C18色譜柱時(shí)，應(yīng)避免高水相流動(dòng)相，以免造成固定相塌陷等問(wèn)題。針對(duì)高水相流動(dòng)相下保留極性分析物的需求，可以選擇其他類型的色譜柱進(jìn)行分析。
