異常峰分析

異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現負峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。異常峰是色譜實驗工作中最棘手的問題。這些峰嚴重影響色譜分析的結果。色譜圖中不可能有純正的高斯對稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離系統所決定的。在此僅對幾種異常峰進行分析。

1.峰前或峰后有小峰的分析

產生原因大致分為以下幾種情形

(1) 樣品不純。可改變不同的流動相和色譜柱 ,對樣品進行分離比較 , 選擇合適的分離條件。

(2) 分析柱或保護柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護柱后對峰形進行比較。柱頭塌陷時往往所有的峰都會出現峰分裂 。對色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。

(3) 色譜柱柱容量下降。當長時間使用后 , 有一些強保留組分吸附在柱子中 , 不大的進樣量往往就會出現峰分裂。用強洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。

(4) 樣品溶劑與流動相不匹配或進樣體積過大。當樣品溶劑比流動相極性大時 , 有時即使進樣體積很小 , 也容易出現峰變形和裂分現象。建議用流動相溶解樣品。

(5) 流動相不恰當。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結構的動態平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會使峰形正常。

(6) 樣品分解。不穩定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質而出現雙峰。這時需改變樣品處理方法或色譜分離條件。

2.負峰分析

在色譜分析中有時會出現負峰或倒峰 , 如圖 3 中的大峰的左下就有一負峰。出現這種現象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對不同情況進行排除 , 進而使問題得到解決。

(1) 流動相吸收本底值過高。此時可適當改變檢測波長。

(2) 進樣過程中進入空氣。進行排氣處理 , 直到基線平穩再進樣。

(3) 樣品組分的吸收低于流動相。可改變流動相或改變檢測波長。

(4) 配制樣品的溶液與流動相不一樣。重新配制樣品 , 用與流動相一樣的溶劑配制或稀釋樣品。

3.前沿、拖尾峰分析

拖尾：1 干擾峰，優化條件分離 ；2 色譜柱塌陷，更換色譜柱； 3 流動相pH不合適，調節pH值 ；4 管路沒有接好，存在較大的死體積，可以重新接一下。

前沿：1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 ；2 樣品過載，降低進樣量； 3 柱溫太低，升高柱溫 ；4 色譜柱損壞，更換色譜柱 ；

圖譜前沿和拖尾的原因主要是流動相選擇不合適，可以相應調整流動相的極性，或者適當加入酸來調整，可以得到較好的改善。一般來講，酸堿在流動相中對于前沿和拖尾影響較大。  柱前沿是可能因為柱超載，拖尾是可能因為樣品被污染，選擇合適的流動相，調節好PH能夠改善這以情況。

前輩們總是會告訴我們，拖尾峰與柱子有關，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做。 有時候托尾峰往往是有機性相近雜質沒有分開，此時，可以優化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由于柱子使用時間太久柱效下降出現塌陷等原因；再有也會根樣品本身性質有關，基團需要流動相中添加能與之結合優化峰形的化學物質，要根據具體情況而定。

4.色譜雙峰產生的可能及判斷和處理

液相上有一句經典的話說得好 “出兩個峰肯定不是一種物質，出一個峰不一定是一種物質”。

而色譜雙峰指的是明是一種物質，但在色譜圖中出現雙峰，而表明含二種物質。我將這種情況分為四種原因。  

1）色譜柱  

如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，高頻紅外碳硫分析儀這是可以將進樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應柱效很低而報廢。  

2）溶劑極性及進樣量  

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內容，而這確是雙峰產生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），將進樣量減少一半以上，峰型將變為正常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。  

3）樣品的特性  

有些樣品由于其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體無法分開，而是以一個動態平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質將出現雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質譜檢測器，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農藥啶蟲瞇（吡蟲清）。  

4）參數

記錄的參數一般都內定的，不必修改，但GC和HPLC的參數是不完全一致的，例如C－R3A數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變為二個峰或更多。

5.鬼峰、倒峰、未出峰

6.峰裂分

裂峰產生原因的確定

• 樣品基質復雜或分析多種樣品——柱污染或部分阻塞濾片

• 流動相 pH>=7——由于硅膠溶解導致柱塌陷(除非使用專門的柱子)

• 溶劑比流動相的強度大——可能產生裂峰或寬峰，由樣品量決定 （溶劑化效應）

7.峰拖尾、峰展寬、峰前伸

峰拖尾原因的確定

• 評價柱選擇——使用高純度硅膠柱或不同鍵合技術柱

• 評價流動相效果——改變流動相pH和添加劑消除次級效應(流動相中組份與柱子相互作用)

• 減小進樣量

• 消除柱外效應

• 沖洗柱子——檢查柱子老化/塌陷

易記小卡片來了：其它常見峰異常問題匯總

Q&A峰問答

進行HPLC分析時，怎樣才能知道某一個色譜峰是否是單一峰呢？特別是分析中藥成分的時候？標準品加入法、DAD、還有改變流動相的組成是否能說明呢？

1、多種不同原理的方法比較是首選。

2、其次采用DAD檢測器進行光譜分析，如果提示不純，估計有問題。純度閾值受儀器、流動相等影響，所以只能作為參考。對于分子結構中差異有紫外吸收官能團的，dad檢測器一般還是可以準確判斷峰純度的，但對于結構中無紫外吸收的那些差異，DAD檢測器就無能為力了，比如某肽鏈中的氨基酸差異、或者一些對應異構體，dad也是無能為力的。

3、如果DAD不行，那么就需要采用質譜鑒別了，優選液質聯用，如果是含鹽流動相，可以采用收集不同時段的色譜流出物的方式，脫鹽，進行質譜檢測。

4、如果懷疑有異構體，這個就比較頭疼了，非對應異構體需要二級（主要是對CID的能量有要求，可以打斷側鏈）的質譜才能判斷側鏈的區別。對應異構體的辨別目前好像只有waters的離子淌度質譜（沒做過）有一定的分辨能力，但也不是萬能的。