研究內容

操作過程

一般技術要點說明

方法摸索優(yōu)化

目標優(yōu)化梯度條件，確定分析波長。

1、 樣品溶劑選擇；

2、 濾膜吸附試驗；

3、 DAD檢測器下，波長選擇主成分最大吸收或平臺處。

4、 分離條件選擇；

5、 色譜柱對比；（根據(jù)情況酌定）

6、DAD檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料（制劑研究時需同時進行空白輔料破壞）等成分分離。

1、 一般在無參考標準或標準的方法無法直接套用時,需進行此項研究內容，如3類藥。

2、樣品溶劑：對樣品有很好的溶解能力，實驗室自然放置穩(wěn)定存放12小時以上，與流動相有良好的互溶效果。

3、續(xù)濾液峰面積達穩(wěn)定最大值，續(xù)濾液體積在5ml以下時較為適宜，否則需要重新篩選溶劑。

4、破壞程度10%左右（5%—15%）為宜，2mol/l酸或堿90℃水浴12小時無破壞即視為樣品穩(wěn)定，不必再追求降解度。4500lx光照48小時，樣品粉末及溶液需要同時做。破壞后的樣品溶液及空白溶劑均需調整至流動相pH方可進樣，可避免對色譜柱產生不良影響。如果破壞超過20%，需要降低破壞條件。

5、分離度良好，測定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

6、梯度變化要有最高洗脫能力過程，目的證明所有的雜質成分均能夠被洗脫檢測。

7、方法摸索優(yōu)化實驗一般是不上資料的，只是體現(xiàn)在實驗記錄本中，除非是沒有方法依據(jù)時，如3類藥申報時，梯度選擇及波長選擇等均需要在資料中體現(xiàn)。

8、方法優(yōu)化完成后，最后在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進行分析測定，具有可比性。

9、方法摸索優(yōu)化實驗采用工藝已經(jīng)確定的實驗室小試、實驗室放大樣品進行，前期用于原料合成樣品配合檢測時，可以采用大范圍的梯度洗脫進行模糊檢測分析。

專屬性

目的為了驗證方法對目標成分檢測的區(qū)分能力及全面的雜質分析評價。

DAD檢測器或適宜的通用型檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料，各雜質對照品等在同一天進行分析，可以作為申報資料中雜質譜的論述內容。

1、參照上述過程進行破壞樣品制備，空白及陰性樣品都要做。

2、分離度良好，測定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

3、梯度要有最高洗脫能力過程。

4、以前期確定的分析條件及方法，在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進行分析測定，具有可比性。

5、本部分數(shù)據(jù)進資料，最佳采用生產線驗證的第1批樣品進行。

當色譜條件與有關物質檢查方法相同時，專屬性實驗數(shù)據(jù)可以共用。

出圖時主成分峰的紫外光譜圖及峰純度圖均要出圖。

檢測限

信噪比法，S/N≥3倍時的濃度為檢測限。

先進空白，再進對照品濃溶液（1mg/ml），在主峰相同位置處選擇空白溶劑1—2min范圍的基線積分得出峰高，按照峰高的3倍計算樣品濃度，直接用濃溶液稀釋至目標濃度附近即可，資料中體現(xiàn)至少3張圖（空白溶劑、濃溶液、及稀釋液）。

定量限

信噪比法，S/N≥10倍時的濃度為定量限。

按照基線峰高的10倍計算樣品濃度，直接用檢測限濃溶液稀釋至目標濃度附近即可，連續(xù)進樣6針，計算峰面積RSD<2%（可以放寬至5%），資料中體現(xiàn)6張圖（6張稀釋液）。與檢測限在同一天做，出圖時縱軸標尺與檢測限一致，減少審評員審圖時的信息誤導，提高審圖效率。

線性與范圍

5點或7點法，酌情設置。

1、第一個點在定量限濃度，中間點為100%濃度，最后一個點為200%濃度（160%或180%），必須采用稀釋法，不得采用調整進樣量的方式。r>0.999。

2、采用對照品進行。

3、線性范圍一定要將回收率試驗的最高濃度包含進去，否則回收率濃度超過線性范圍，缺乏定量依據(jù)，這個錯誤非常常見。

精密度

同一份供試品（樣品）溶液，連續(xù)進6次。

1、計算峰面積RSD<2%，資料中體現(xiàn)7張圖（1張空白，6張樣品液）。

2、進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

溶液穩(wěn)定性

與精密度在同一天穿插進行，實驗前進行良好的排序設置，能共用的圖盡量共用減少工作量。以下時間點必做（除非已知穩(wěn)定性情況可減少時間點）。

0、4、6、8、10、12、18、24。

1、實驗過程中可取精密度中的圖作為2h或4h，甚至6h。

2、做7至8個時間點，在撰寫申報資料時最后以6個數(shù)據(jù)填報。

3、溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)至少做到16h穩(wěn)定（盡量做得更長時間，都是自動進樣，一個過夜就至少在12小時以上，時間太短無法證明溶液穩(wěn)定性），極特殊情況下可以采用低溫進樣器或特殊的保存方法或現(xiàn)配現(xiàn)分析等操作，但要求有數(shù)據(jù)作為支持依據(jù)，方可將特殊處理方法定入標準。

4、6個數(shù)據(jù)計算峰面積RSD<2%。

重復性

同一批號樣品，同一人員同法操作分別稱取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進1次。

1、計算含量RSD<2%，資料中體現(xiàn)9張圖（1張空白，2張對照，6張樣品）。

2、進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

中間精密度

同一批號樣品，不同人員，不同設備，同法操作，分別稱取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進1次。推薦次日操作，避免產生壓針的疑問（萬一審評老師沒有注意到設備編號，所以別自找麻煩，推薦次日操作）。對照品也要重新稱取。

與重復性的6個數(shù)據(jù)，共同參與統(tǒng)計，計算12個含量數(shù)據(jù)結果，RSD<2%，資料中體現(xiàn)18張圖，其中重復性9張，次日數(shù)據(jù)9張（1張空白，2張對照，6張樣品）。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

準確度

采用回收率試驗方式進行，通常采用直接回收率實驗法，按照80%、100%、120%比例分別稱取樣品，同法操作，每個比例各3份樣品，各進1次。

1、以中間精密度的含量均值作為理論含量，計算回收率，回收率變動范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

2、原料藥采用直接回收率。

3、制劑采用加樣回收率測定：采用20片或粒制劑單位終產品混合研碎后，按比例稱取進行加樣回收，加樣回收率采用80%、100%、120%比例，1:1加入，加樣回收率不能達標時（輔料有吸附或干擾較大時），方可采用直接回收率。回收率變動范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。

耐用性實驗

改變色譜柱

不同品牌的色譜柱，共3個品牌。比較分離度，保留時間，含量測定結果。

如果品牌不足3個可采用多個批號或不同品牌多個批號的方式，不能采用廢柱子進行實驗。

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進行。

2、3個品牌的色譜柱共15張圖（每個色譜柱1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。

流動相比例

流動相的低組分比例變化約±5%。

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進行。

2、3個不同比例的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。最優(yōu)標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

流速變化

流速±10%。

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進行。

2、3個不同流速的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。最優(yōu)標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

不同pH

pH值±0.2

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和兩份對照溶液進行。

2、3個不同pH的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。最優(yōu)標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

柱溫

柱溫±5℃

25℃、30℃（或最優(yōu)參數(shù)）、35℃

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和一份對照溶液進行。

2、3個不同溫度15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣品進行。最優(yōu)標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認。

0天樣品檢測

方法學研究結束且各項考察數(shù)據(jù)符合要求后，對3批生產線驗證樣品及被仿品在同一天進行檢測。此數(shù)據(jù)在申報資料產品檢驗報告單中體現(xiàn)，且可作為穩(wěn)定性的0天數(shù)據(jù)。

雙樣雙針。對照品也為雙樣雙針。