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做液相繞不過的6個(gè)要點(diǎn)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2023-08-30
核心提示:開發(fā)方法或方法驗(yàn)證時(shí)最重要的一步就是流動(dòng)相的選擇和比例的調(diào)整。我想大家肯定都遇到過分離度不好或峰形不好的情況,大部分原因
開發(fā)方法或方法驗(yàn)證時(shí)最重要的一步就是流動(dòng)相的選擇和比例的調(diào)整。我想大家肯定都遇到過分離度不好或峰形不好的情況,大部分原因就是流動(dòng)相沒調(diào)好,那到底該怎么調(diào),怎么選擇呢?看完下文可能你就知道答案了。


01 由強(qiáng)到弱


一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn),這樣可以很快地得到分離結(jié)果,然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

02三倍規(guī)則



每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量,保留因子約增加3倍,此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中,注意觀察各個(gè)峰的分離情況。



03 粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)


當(dāng)分離達(dá)到一定程度,應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%,并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率,直至各組分的分離情況不再改變。


1、流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面:


①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮,從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān),特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時(shí),所用流動(dòng)相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收,或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時(shí),應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相,以提高靈敏度。
④粘度要低(應(yīng)<2cp)。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì),降低柱效,還會(huì)使柱壓降增加,使分離時(shí)間延長。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳,樣品會(huì)在柱頭沉淀,不但影響了純化分離,且會(huì)使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。


2.流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時(shí),通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,以抑制樣品組分的解離,增加組分在固定相上的保留,并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸,流動(dòng)相的pH值越小,組分的k值越大,當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí),弱酸主要以分子形式存在;對(duì)弱堿,情況相反。分析弱酸樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液;分析弱堿樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。注:流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用,減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺(如三乙胺)又稱為減尾劑或除尾劑。
三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個(gè)乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發(fā)的無色液體,有氨的氣味。熔點(diǎn)-114.7℃,沸點(diǎn)89.3℃,相對(duì)密度0.7275(20/4℃)。溶于水和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。三乙胺有堿性,與無機(jī)酸能生成易溶于水的鹽類。可由N,N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應(yīng)制取,也可用乙醇胺進(jìn)行氣相烷基化反應(yīng)合成。用于制橡膠硫化促進(jìn)劑、潤濕劑和殺菌劑等,也可用作溶劑和用于合成四級(jí)銨化合物。
3. 如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前,應(yīng)先了解被分析物的Pka,高于或低于Pka兩個(gè)PH值單位的,有助于獲得好的、尖銳的峰,從HH公式:PH=Pka+log([A-]/[A])得知,溶液PH值高于或低于Pka兩個(gè)單位,化合物中99%以一種形式存在,而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉(zhuǎn)變,苯甲酸的Pka等于4.2,理論上由HH公示得知,當(dāng)溶液PH值等于2.2時(shí),99%的苯甲酸以中性化合物存在,PH值等于6.2時(shí)99%的苯甲酸以離子形式存在,所以當(dāng)緩沖液PH值等于2.2時(shí),中性化合物以羧酸形式保留于反相柱。



4.流動(dòng)相的脫氣HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣,否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡,影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率,影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性,甚至使無法檢測。(噪聲增大,基線不穩(wěn),突然跳動(dòng))。
此外,溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相(如烷基胺)反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化,對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑(如甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡(luò)合物,此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收(特別是在260nm以下),并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低,但更重要的是,會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。在熒光檢測中,溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象,特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下,熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測中(特別是還原電化學(xué)法),氧的影響更大。
除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能,也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有:加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑,若采用抽氣或煮沸法,則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好,10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了(一般500ml溶液需超聲20~30min方可),此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸,以免玻璃瓶破裂,容器內(nèi)液面不要高出水面太多。離線(系統(tǒng)外)脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài),在你停止脫氣后,氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi),溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
在線(系統(tǒng)內(nèi))脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡,即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí),將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說,此方法不能將溶劑脫氣,它只是用一種低溶解度的惰性氣體(通常是氦)將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī)。
一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除,而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法,這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴,難于普及。
5.流動(dòng)相的濾過所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm(或0.22μm)濾過,以除去雜質(zhì)微粒,色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過”)。用濾膜過濾時(shí),特別要注意分清有機(jī)相(脂溶性)濾膜和水相(水溶性)濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑,過濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過濾水溶液,嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑,否則濾膜會(huì)被溶解!溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對(duì)于混合流動(dòng)相,可在混合前分別濾過,如需混合后濾過,首選有機(jī)相濾膜。現(xiàn)在已有混合型濾膜出售。

6.流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi),不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑,導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng),可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán),防止溶劑揮發(fā)引起組成變化,也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉,應(yīng)盡量新鮮配制使用,不要貯存。如確需貯存,可在冰箱內(nèi)冷藏,并在3天內(nèi)使用,用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗,特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子,以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。

7.鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì),能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解,不能存放太久。鹵代溶劑(如CCl4、CHCl3等)與各種醚類(如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等)混合后,可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物,這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用,或新鮮配制。此外,鹵代溶劑(如CH2Cl2)與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑(如乙腈)混合靜置時(shí),還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶。總之,鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合,則不會(huì)產(chǎn)生類似問題。

04 流動(dòng)相溶劑的選擇


1.所選用的流動(dòng)相溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性,不與固定相和樣品組分起反應(yīng),其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。
2.溶劑應(yīng)當(dāng)不干擾檢測器的工作,溶劑應(yīng)與檢測器匹配,選擇不影響檢測器正常工作應(yīng)選擇在測定波長范圍內(nèi)無吸收的流動(dòng)相。
3.在制備分離中, 溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去, 不干擾對(duì)分離組分的回收。
4.溶劑的粘度要小,保證合適的柱壓降。
5.從實(shí)用角度考慮,溶劑應(yīng)當(dāng)價(jià)格低廉,容易購得,使用安全,純度要高。



05 流動(dòng)相溶劑使用的注意事項(xiàng)


1.流動(dòng)相溶劑應(yīng)選擇HPLC的溶劑或依此為標(biāo)準(zhǔn)的溶劑。流動(dòng)相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣,清除微粒和灰塵。在送液泵內(nèi),為了防止雜物(固體)進(jìn)入流路,裝有吸濾器,但網(wǎng)孔徑為10μm,比此更小的顆粒仍然可通過,這會(huì)導(dǎo)致流路和柱子堵塞和污染。為此,建議常用0.45μm濾膜過濾。流動(dòng)相溶劑須經(jīng)脫氣,如不脫氣,在溶劑混合時(shí),或壓力溫度變化時(shí)容易產(chǎn)生大量氣泡,會(huì)導(dǎo)致泵誤動(dòng)作和輸液不暢,檢測器產(chǎn)生噪聲信號(hào)等。

2.流動(dòng)相恢復(fù)到室溫后使用。流動(dòng)相溫度與室溫相差時(shí),流動(dòng)相在恢復(fù)到室溫前,基線水平很難穩(wěn)定,特別是發(fā)生漂移,也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機(jī)溶劑混合時(shí),混合液變化大,往往會(huì)與室溫相差很大,務(wù)必注意。
3.做HPLC流動(dòng)相的試劑應(yīng)用HPLC級(jí)的、水應(yīng)用二次蒸餾水,水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換,防止長菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水(炊用)并不合適、尤其是做梯度洗脫時(shí),水中的不純物會(huì)成為鬼峰,從而干擾分析結(jié)果。
4.流動(dòng)相的pH值過高或過低,流動(dòng)相使用純水,使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液,使用離子對(duì)試劑等,均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞,這種對(duì)色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的。
5.用緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí),在使用前和使用后都要用水清洗流路,絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時(shí)間。
6.若需要使用含鹽的流動(dòng)相,使用前請(qǐng)務(wù)必過濾。并且使用該含鹽流動(dòng)相前,色譜柱需先用低比例有機(jī)相(有機(jī)相含量應(yīng)不低于10%)的溶液沖洗,以免緩沖鹽析出。流動(dòng)相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液,建議現(xiàn)用現(xiàn)配,以免流動(dòng)相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
7.進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意梯度變化過程中流動(dòng)相的互溶性,避免因流動(dòng)相不互溶而導(dǎo)致的緩沖鹽析出問題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時(shí),用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲(chǔ)存流動(dòng)相后在接柱子。
8.在更換兩種互不相溶的流動(dòng)相時(shí),中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如:先用甲醇水做流動(dòng)相,然后在用正己烷做流動(dòng)相時(shí),一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水,然后用正己烷沖洗異丙醇,反之也是一樣。在更換流動(dòng)相時(shí)還要考慮色譜柱是否更換。
9.儀器在短期(兩三天)不用時(shí),流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時(shí),流路中應(yīng)用甲醇。
10.對(duì)于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時(shí),要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動(dòng)相溶劑,如甲醇、乙腈等。
11.當(dāng)流動(dòng)相溶劑為乙腈時(shí),流速為1ml/min泵的正常壓力5~7Mpa之間,如果壓力逐漸降低,基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大,導(dǎo)致泵的流速降低。可適當(dāng)提高流速使泵的壓力恢復(fù)正常即可。
12.流動(dòng)相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑,會(huì)對(duì)流路中的PEEK樹脂管路強(qiáng)度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動(dòng)相含有鹵素離子的溶劑,如KCI、NaCI、NH4CI等。對(duì)流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用,以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時(shí),分析完了后,應(yīng)立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
13.用于檢定梯度等性能時(shí),短時(shí)間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
14.注意:稀硝酸與甲醇不能混合,否則有可能會(huì)引起爆炸。


06 液相色譜流動(dòng)相的貯存


流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi),不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑,導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng),可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán),防止溶劑揮發(fā)引起組成變化,也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉,應(yīng)盡量新鮮配制使用,不要貯存。如確需貯存,可在冰箱內(nèi)冷藏,并在3天內(nèi)使用,用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗,特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子,以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。


文章(文字)來源:網(wǎng)絡(luò) 
編輯:songjiajie2010

 
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