【干貨】凝膠色譜使用的注意事項(xiàng)

發(fā)布日期：2021-12-08

核心提示：凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑

凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。今天，咱們重點(diǎn)聊一聊凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。根據(jù)分離的對象是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

根據(jù)分離的對象是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

凝膠過濾色譜：

凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。

凝膠滲透色譜：

凝膠滲透色譜法主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機(jī)溶劑。

凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時(shí)根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下。

近年來，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達(dá)到完全的分離純化的目的。

凝膠色譜法又稱體積排阻色譜法，使用水溶液流動(dòng)相的稱為凝膠過濾色譜，使用有機(jī)溶劑流動(dòng)相的稱為凝膠滲透色譜。凝膠色譜的固定相是多孔物質(zhì)，如多孔凝膠、交聯(lián)聚苯乙烯、多孔玻璃及多孔硅膠等。試樣是按照其中各組分分子大小的不同而分離的。大于填料微孔的分子，由于不能進(jìn)入填料微孔，而直接通過柱子，Z先流出柱外，在色譜圖上Z早出現(xiàn)，小于填料微孔的組分分子，可以滲透到微孔中不同的深度，相對分子質(zhì)量Z小的組分，保留時(shí)間Z長。

凝膠色譜與凝膠層析是否一樣？

基本上是一致的只是固定相存在差異。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。

凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。

兩者的共同點(diǎn)是都不需要有機(jī)溶劑。凝膠色譜色譜一般用在HPLC等分析場合。而凝膠層析一般用在制備的時(shí)候。

凝膠凈化柱和凝膠色譜柱是一回事嗎?

原理是一回事，都是排阻色譜。但是前者是制備柱，對大量樣品進(jìn)行分離，柱子口徑大，一般要有切割承樣的尾接裝置；后者是分析柱，主要目的是對小量樣品進(jìn)行分析，柱子直徑小，一般還有柱溫箱，對泵的穩(wěn)定性要求高，必須接檢測器。

1、Sephadex G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克，同樣G-200克每克干膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。

2、Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有：

⑴疊氨鈉（NaN3）

在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時(shí)約為40%；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。

⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]

在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果Z佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時(shí)易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉

在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%。在微酸性溶液中Z為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。

⑷苯基汞代鹽

在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果Z佳，長時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。
注意事項(xiàng)

溶劑準(zhǔn)備：使用HPLC純?nèi)軇�，如有必要，進(jìn)行過濾。保證溶劑的相溶性，避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。

溶劑脫氣：超聲脫氣。

樣品準(zhǔn)備：過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒，用流動(dòng)相溶解樣品。

色譜柱的保護(hù)：

1、防止氣體進(jìn)入色譜柱。

凝膠柱是不允許氣泡進(jìn)入的，否則將會(huì)使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此，為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱，一定要使用經(jīng)過脫氣的流動(dòng)相，并且要嚴(yán)格按照下列步驟來安裝色譜柱。

a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；

b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進(jìn)入；

c.如無溶劑滲出時(shí)，表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了，此時(shí)，可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上，以流動(dòng)相來反方向沖洗色譜柱，以便將柱內(nèi)的空氣排除。最好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會(huì)導(dǎo)致柱性能的降低；

d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了。

2、色譜柱的清洗。

為了不使被測物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應(yīng)及時(shí)地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時(shí)應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動(dòng)相是緩沖溶液，則應(yīng)先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內(nèi)的鹽，然后再用合適的溶劑來沖洗。

凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動(dòng)相，用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續(xù)操作，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過夜，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動(dòng)相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。

3、色譜柱的存放。

如果色譜柱暫時(shí)不用，存放時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：

a.幾天之內(nèi)的短期放置，凝膠柱則用蒸餾水來沖洗，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。

b.如果色譜柱長期不用，僅用上述方法來處理就不行了，這時(shí)應(yīng)使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱，凝膠柱則不能用水了，因柱內(nèi)如果有微生物的生長則會(huì)使柱效降低，此時(shí)應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴(yán)。色譜柱長期放置時(shí)，一定要將色譜柱的兩端封嚴(yán)，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象，因這可導(dǎo)致柱效的嚴(yán)重降低。

c.色譜柱應(yīng)貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里，柱內(nèi)就會(huì)結(jié)冰，這也將導(dǎo)致柱效的降低。

4、不要高溫使用。

5、不要高壓沖洗柱子

對儀器的維護(hù)和保養(yǎng)進(jìn)行記錄。

編輯：songjiajie2010

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