概述

化學(xué)發(fā)光作為一種分析工具的吸引之處就在于檢測的簡單性。化學(xué)發(fā)光的實(shí)質(zhì)是自身發(fā)光，這意味著化學(xué)發(fā)光的分析測試儀器只需要提供一種可以檢測光信號(hào)和紀(jì)錄結(jié)果的方法就可以了。自發(fā)光檢測儀需要一個(gè)閉光的樣品室和光檢測器。最簡單的便是相片紙或X光片，甚至視覺檢測器都可以。

化學(xué)發(fā)光檢測方法的簡單性使得它的應(yīng)用很簡單并且完全可以自動(dòng)化。但是它的靈敏度又是怎么樣的呢？化學(xué)發(fā)光有如下兩個(gè)內(nèi)在的優(yōu)勢：

1．絕大多數(shù)的樣品沒有“背景”信號(hào)，如它們自身不發(fā)光。

2．化學(xué)發(fā)光的檢測不是一個(gè)比例測試，這是與熒光和吸收或比色測試不同的。在熒光測試中，具有小的Stokes Shift的熒光基團(tuán)非常難檢測。熒光很難從激發(fā)波長中分辨出來。

另外一個(gè)問題是，特別在樣品是渾濁的情況下有一部分雜光會(huì)進(jìn)入到檢測器。

在吸收光測試上，其靈敏度受到限制的根本因素是需要在兩個(gè)相對較強(qiáng)的信號(hào)之間去區(qū)分一個(gè)較小的差別。

需要注意的是檢測器對光譜的敏感性近可能接近化學(xué)發(fā)光的光譜，以得到最大化的靈敏度。一般在自發(fā)光儀中的光電倍增管對藍(lán)光有最佳的反應(yīng)，對紅光的末端光譜不太敏感。固態(tài)檢測器對紅光有較好的反應(yīng)。

X光片廣泛用于記錄在尼龍膜、纖維素膜或PVDF膜上的化學(xué)發(fā)光印跡分析。但是我們需要牢記在心的是X光片僅能夠用于檢測紫外到藍(lán)光光譜范圍內(nèi)的光信號(hào)，雖然有一些特殊的光片對增強(qiáng)的綠光有敏感性。

液體樣品的檢測

有一些特定的詞來描繪化學(xué)發(fā)光檢測：靈敏度、線性和動(dòng)態(tài)范圍。每一個(gè)詞的意義如下：

1．靈敏度指的是某種東西可靠檢測的最低水平。“某種東西”是指在一個(gè)分析測試中的測試物。測試物是被標(biāo)記了一種可檢測的東西，如化學(xué)發(fā)光化合物或的一種酶。分析物也可以是一種通過與具有標(biāo)記的親合物有特異性結(jié)合反應(yīng)而檢測的物質(zhì)。所謂的可靠檢測指的是針對一個(gè)空白測試樣品，檢測器能夠重復(fù)感應(yīng)到最低水平的信號(hào)，而這種信號(hào)是由所檢測物本身產(chǎn)生的。

2．線性描述的是信號(hào)與分析檢測物濃度范圍之間的關(guān)系。理想的比例因子是常數(shù)；信號(hào)點(diǎn)與分析檢測物是一條直線關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以不是直線，如s形，仍是有用的。

3．動(dòng)態(tài)范圍指的是被檢測物濃度與信號(hào)單一模式的變換范圍。它定義的是分析的工作范圍。

你期望通過化學(xué)發(fā)光得到什么水平的靈敏度呢？答案不一定會(huì)滿足你的要求，“它是有條件的”。在很少情況下，檢測器的靈敏度或化學(xué)發(fā)光方法會(huì)是檢測的局限因素。現(xiàn)在的檢測器可以達(dá)到很高的靈敏度。大多數(shù)情況下，而是其它的一些因素顯示了分析檢測的靈敏度。最通常的是生物成分（抗體、酶等）的非特異性結(jié)合到反應(yīng)容器和支持物的表面。例如，免疫分析，印跡實(shí)驗(yàn)，核酸雜交和其它的酶聯(lián)結(jié)合實(shí)驗(yàn)都是受制于此因素。

管和微孔板

玻璃、透明或半透明的塑料管、比色皿是化學(xué)發(fā)光測試比較理想的材料。理想的是光能夠通過一個(gè)平面然后測試，以減少邊際效應(yīng)。曲面也可以使用，如圓柱型的測試管。用不同的測試管測試比較結(jié)果，這些管必須是統(tǒng)一生產(chǎn)的，才可以比較結(jié)果。

微孔板——從化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中發(fā)射出的光是各向同性的，即在各個(gè)方向上同等發(fā)射出來的。如果一個(gè)化學(xué)反應(yīng)是在透明的微孔板中的微孔中進(jìn)行，光不僅從垂直方向發(fā)散，還從水平方向發(fā)散出來。光很容易的通過各個(gè)孔之間的間隙和孔壁。光較強(qiáng)的孔就會(huì)干擾相鄰的孔。因此，化學(xué)發(fā)光測試一般不用透明微孔板。

不透明的微孔板和板條主要有兩種——白色和黑色。使用者需要注意的是黑色的因?yàn)橛泄馕�收，所以它的信�?hào)會(huì)比白色板有很明顯的減弱（將近10倍）。因?yàn)樗�有的孔是同等比例的收到影響，所以不管他們的�?qiáng)度，定量并沒有問題。白色或黑色板的選擇，主要是基于預(yù)期檢測信號(hào)的強(qiáng)弱，白色板用于檢測較弱光的檢測，黑色板用于檢測強(qiáng)光的檢測。黑色板的另一優(yōu)點(diǎn)就是可以削弱非特異性結(jié)合所帶來的問題。

此外，白色板并不是完全同等不透明。為熒光設(shè)計(jì)的白板的白色素比用于化學(xué)發(fā)光的白板的要少的多。在熒光檢測時(shí)，每檢測一次，一般在針對一個(gè)孔，消除了相鄰孔之間的干擾。白色微孔板的好壞很容易檢測，只要在板的后面放上一只燈，然后看每個(gè)孔。如果穿過的燈光不僅僅是淡淡的，那么用于較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物的分析是會(huì)有一些問題的。

固相樣品的檢測（印跡膜）

X光片——它已經(jīng)被認(rèn)為是對固定在膜上的蛋白或核酸進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測的強(qiáng)有力的工具，如Southern、Northern和Western雜交的化學(xué)發(fā)光檢測。此類商業(yè)化的產(chǎn)品已非常廣泛。

如果能夠控制好非特異性的結(jié)合，靈敏度是足夠的。如果不能很好控制，將會(huì)X光片上曝光過度。解決這個(gè)問題的最好策略是減少結(jié)合的試劑的量，例如抗體或類似物。曝光時(shí)間1到10分鐘通常是足夠顯現(xiàn)大多數(shù)的印跡。更長的很少能提高信號(hào)/背景。

關(guān)于靈敏度相對的方面來講，未得到信號(hào)并不意味著分析物的不存在。任何一種光學(xué)用膜片都有一個(gè)強(qiáng)度閾值，在這個(gè)閾值之上銀顆粒的光化學(xué)轉(zhuǎn)化才能成功。否則會(huì)失敗，稱之為“可逆失敗”。在實(shí)際操作中，化學(xué)發(fā)光信號(hào)低于閾值強(qiáng)度的結(jié)果僅是簡單的沒有記錄。更長時(shí)間的曝光也不能克服這個(gè)問題。可以通過一些方法來改進(jìn)，在曝光之前如把膜片放在氫氣和氮?dú)獾幕旌蠚怏w中預(yù)閃，即用低強(qiáng)度的光短時(shí)間的照射膜片，以提高光學(xué)顆粒的光子。

CCD成像技術(shù)——最近，基于CCD的影像系統(tǒng)已成為化學(xué)發(fā)光印跡結(jié)果獲得和記錄的好工具。這些系統(tǒng)在信號(hào)測試的動(dòng)態(tài)范圍上表現(xiàn)出很好的效果。CCD的量度大小為3～4個(gè)級(jí)數(shù)，而X光片僅為1個(gè)級(jí)數(shù)。攝像時(shí)間短，并且可以獲得多個(gè)影像和容易存儲(chǔ)。雖然需要投入設(shè)備的購置費(fèi)，但是可以節(jié)省膜片和其它的投入。

設(shè)備（光電倍增管）

在發(fā)光儀上，PMT為傳統(tǒng)的選擇。它們的優(yōu)勢包括良好的靈敏度，寬廣的動(dòng)態(tài)范圍和較寬的光譜相應(yīng)。因?yàn)镻MT具有很低的暗電流，使得它們具有極佳的信噪比。

PMT有兩種基本模式——單光子計(jì)數(shù)和電流感應(yīng)。有些復(fù)合系統(tǒng)是在每秒百萬個(gè)光子以下為單光子模式，超過之后為電流感應(yīng)。

PMT單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)是超靈敏的。用這類檢測器主要是為了滿足靈敏度要求較高的測試和定量。越高要求的靈敏度，價(jià)格越高。樣品測試室必須是光密閉性非常好的。如果光太強(qiáng)會(huì)損害PMT。

PMT電流感應(yīng)系統(tǒng)也能獲得較好的靈敏度，經(jīng)常用于比單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)檢測的更強(qiáng)的光。

對于選擇何種模式的PMT檢測器，需要與你的實(shí)際需要結(jié)合起來選擇。現(xiàn)在，這兩種檢測器的化學(xué)發(fā)光儀操作都比較簡單，靈敏度也都比較好。對此有一個(gè)正確的理解，你就可以選擇一個(gè)比較適合你的應(yīng)用的設(shè)備。

PMT主要應(yīng)用在液相中化學(xué)發(fā)光的檢測，儀器形式可以為管式和板式。其檢測結(jié)果單位值為RLU（Relative Light Unit），各個(gè)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品其對RLU的定義會(huì)有所不同。

固態(tài)檢測

光電二極管能夠感應(yīng)比光電倍增管所感應(yīng)的更強(qiáng)的光強(qiáng)度。對于那些需要測試高強(qiáng)度光的應(yīng)用，選擇這樣的檢測器比較好。然而，固態(tài)檢測器的暗電流比光電倍增管一般要高很多。解決這個(gè)問題的方法之一是通過Peltier或者是其它的熱電制冷設(shè)備冷卻固態(tài)檢測器。在0～30攝氏度范圍內(nèi)，固態(tài)檢測器的暗電流隨溫度的降低會(huì)急劇下降。冷卻的檢測器能夠整合1到100秒范圍內(nèi)所檢測到光信號(hào)而不會(huì)被暗電流所覆蓋。

CCD和其它的固態(tài)檢測器擁有以下幾個(gè)內(nèi)在的優(yōu)點(diǎn)：

1、在可見光譜范圍內(nèi)，固態(tài)檢測器有一個(gè)較好的光譜響應(yīng)。發(fā)光反應(yīng)發(fā)出紅光，甚至近紅外光。

2、CCD影像系統(tǒng)可以對不同的目標(biāo)物進(jìn)行檢測。基本上任何一種樣品或容器都可以適用，如微孔板，細(xì)菌測試管或細(xì)胞培養(yǎng)皿，電泳凝膠和印跡膜。

3、單個(gè)PMT系統(tǒng)在測讀之前必須對樣品位置進(jìn)行定位。樣品管重復(fù)多次帶到一個(gè)固定位置，然后重復(fù)測讀。微孔板PMT測讀儀依賴于微孔之間的標(biāo)準(zhǔn)間隔，能夠按照一個(gè)預(yù)算好的位置移動(dòng)微孔板，由此微孔一個(gè)接著一個(gè)的測讀。而攝像系統(tǒng)測讀一個(gè)樣品不需要預(yù)先知道它的位置，例如膜上的一個(gè)條帶。影像系統(tǒng)能夠把樣品的濃度和位置信息給出。

4、CCD影像系統(tǒng)能夠同時(shí)獲得大量樣品的信息。如對96、384或更多數(shù)目的微孔板的數(shù)據(jù)的同步收集并不是一個(gè)奢望。固態(tài)影像系統(tǒng)可以一次就獲得整個(gè)微孔板的影像和定量。

儀器設(shè)計(jì)者或終端使用者需要注意的是影像檢測器對于微孔板樣品的檢測存在一個(gè)重大的缺陷：三維的微孔板相比于二維檢測物（如膜）會(huì)產(chǎn)生一個(gè)邊際效應(yīng)。因?yàn)楣鈴?qiáng)度按照距離平方的倒數(shù)逐漸變?nèi)酰�所以把攝像頭放到盡可能離板近的地方由此可以得到最好的結(jié)果。然而，因?yàn)榭资怯猩疃龋�最遠(yuǎn)孔的整個(gè)底部就可能看不到。這個(gè)孔的邊緣部分的光信號(hào)就很可能檢測不到。

提高攝像頭將削減檢測器所獲得的整體的光強(qiáng)度。幾何計(jì)算模式可以拿來應(yīng)用以彌補(bǔ)邊際強(qiáng)度的丟失，但是外圍孔的信噪比必然比中央孔的要差。

CCD應(yīng)用最普遍的設(shè)備系統(tǒng)為帶制冷CCD的化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)。為了提高檢測速度和通量，有時(shí)也把CCD應(yīng)用到高通量的板式化學(xué)發(fā)光檢測儀上。

輔助設(shè)備

大多數(shù)研究用的發(fā)光儀和發(fā)光免疫分析儀都裝有一些輔助裝置，如樣品孵育，樣品注射器，光學(xué)濾光片等。

1.、溫度控制——有時(shí)需要的結(jié)果進(jìn)行比較，會(huì)因?yàn)闇囟鹊牟煌�而收到干擾。特別是在一些酶催化的“glow”型的反應(yīng)需要幾分鐘才能達(dá)到高峰，溫度的變化會(huì)導(dǎo)致測試到的強(qiáng)度發(fā)生變化，降低分析的精確性。如果能夠控制樣品的溫度和反應(yīng)溫度的統(tǒng)一，可以使得反應(yīng)在固定條件下進(jìn)行。樣品發(fā)光強(qiáng)度可能由幾個(gè)因素造成的：溫度依賴的酶動(dòng)力學(xué)和隨后的底物化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。緩沖液的pH值加上溫度的影響可以引起信號(hào)的顯著變化。

2、單色分光和濾光片可以分離特定的波長或光譜范圍的光。在化學(xué)發(fā)光應(yīng)用中一般沒有特殊的要求，它們是不需要的。在同一個(gè)反應(yīng)體系中有兩種能夠發(fā)出不同光譜的發(fā)光物，其目的是為了分析檢測兩種不同的測試物。如在生物化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移中，就用濾光片來分析蛋白質(zhì)的相互結(jié)合。波長的選擇不免會(huì)降低檢測器上的光通過量從而倒是靈敏度的損失。

3、中性濾光片——使用中型濾光片可以是檢測設(shè)備的檢測范圍延伸2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。由特制的淺灰玻璃組成，放置于樣品與監(jiān)測器之間，這些濾鏡起到類似“太陽鏡”的作用將所有波長的光都以相同的因子進(jìn)行減弱。使用此校正因子將測量得到的光校正到“真實(shí)”的強(qiáng)度。

4、注射器可以使得底物或啟動(dòng)劑能夠以精確的時(shí)間加入。對于一個(gè)隨時(shí)間光信號(hào)產(chǎn)生變化的動(dòng)力學(xué)樣品來說，這是非常重要的。