在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。載體（vecors）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)（genomic library）,另一種是cDNA庫(kù)。

載體　所謂載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。

細(xì)菌質(zhì)粒 是一種細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對(duì)細(xì)菌的某些代謝活動(dòng)和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。

噬菌體（phaeg） 噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。

黏性質(zhì)粒（cosmid） 是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種4-6kb的環(huán)狀雜種DNA。

表達(dá)型載體 將上述細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動(dòng)基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達(dá)型載體。

基因庫(kù)的建造

含有某種生物體全部基歷的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過標(biāo)記探針與基因庫(kù)中的重組子雜交等方法而篩選出來，所得到的克隆經(jīng)過純化和擴(kuò)增，可用于進(jìn) 一步的研。其主步驟包括：（1）構(gòu)建基因庫(kù)迅速的載體；(2)DNA片段的制備；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝和接種。

cDNA庫(kù)的建造

是指克隆的DNA片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自mRNA制備的cDNA。cDNA庫(kù)包括某特定細(xì)胞的全部cDNA克隆的文庫(kù)，不含內(nèi)含子。

特異基因的篩選

常用的方法有：（1）克隆篩選即探針篩選法；（2）抗體檢測(cè)法，檢測(cè)其分泌蛋白質(zhì)來篩選目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（4）免疫沉淀法，進(jìn)行特異基因的篩選。

核酸序列測(cè)定

DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測(cè)序，sequencing）是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無論從基因庫(kù)中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴(kuò)增的基因，最終均需進(jìn)行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對(duì)功能的影響，幫助人工俁成基因、設(shè)計(jì)引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制等。測(cè)序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動(dòng)測(cè)定儀問世。化學(xué)降解法是在DNA的片段的5`端標(biāo)記核素，然后用專一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測(cè)讀序列和進(jìn)行比較。一般能讀出200-250個(gè)核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長(zhǎng)，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進(jìn)行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長(zhǎng)衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，可推算出模板DNA分子的序列。

化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，重復(fù)性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運(yùn)用，合成的引物容易獲得，測(cè)序技術(shù)不斷改進(jìn)，故此法已被廣泛應(yīng)用。基脫氧法的自動(dòng)激光熒光測(cè)序儀，使測(cè)工作更快速和簡(jiǎn)便，而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測(cè)序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測(cè)序，然后反推RNA序列