（一）基本原理

混合樣品的氣流通過固定相時，根據各組分對固定相的吸附強弱不同使不同成分得到分離。

利用氣相色譜層析技術做為微生物診斷的工具已成功地用于微生物的分類和鑒定。該法敏感性強，能夠分離和檢測到毫微克的水平。它具有快速的特點，常在數十分鐘甚至數小時就可以對傳染病做出早期診斷。其結果穩定，重復性好，但不足之處是操作中各因素不易控制，方法不易標化等。

（二）氣相色譜儀的基本部件

1． 載氣 常用的載氣主要有氮、氬、氫和二氧化碳等。這些氣體一般都由高壓氣瓶供給。

2． 進樣器 氣相色譜儀可以用于分離固相、氣相和液相標本。液相標本采用微升注射器穿過橡皮隔片注入，氣相標本采用特種氣相注射器注入。

3． 譜柱及加熱爐 色譜柱一般由金屬或玻璃制成，通常采用的柱長2m~4m，內徑2mm, 毛細管柱長度可達20m～150m，內徑為0.2mm。

載體一般采用惰性、多孔的固體顆粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同極性的微生物化合物，為了獲得最適的分離條件，要求有不同固定相的載體。目前比較常用的載體有：聚乙二醇（CarbOwax 20M）、F F A P（聚乙二醇20M和2-硝基對苯二甲酸的反應產物），OV—17（苯基甲基硅酮）。OV-210、SE-30（甲基硅酮）、Chromosorb G（白色硅藻土載體）等。柱加熱爐在溫度控制上是非常重要的。

4． 紀錄儀

5． 數據處理裝置 一般均附有數據處理計算機。

（三）試驗條件的選擇

1． 色譜柱的選擇 要注意極性及最高使用溫度，柱溫不能超過最高使用溫度。固定相按極性相似的原則選擇。

色譜柱的內徑大小、長度都能影響分離率。一般而言，內徑越小，長度越長，分離效果越好，一般柱長為1m～5m（毛細管柱則20m～100m）。

填充劑顆粒一般采用40目～60目，60目～80目及80目～100目大小。長柱子宜用粒度大些的，以減少柱壓降，短柱子則用粒度細的。

氣相色譜中固定液的含量對分離效率的影響較大。一般采用固定液與載體重量之比為15︰100～25︰100。采用高靈敏度的檢測器，由于進樣量減少，固定液含量可以降至5︰100以下。這樣可以使用較低柱溫，從而提高柱效，縮短分析時間。但固定液用量太少會引起吸附。

2．柱溫選擇 柱溫選擇對分離度影響很大，常是條件選擇的關鍵。選擇的基本原則是：在使最難分離的組分有盡可能好的分離高度的前提下，盡可能采取較低溫度，但以保留時間適宜及不拖尾為度。

⑴ 高沸點混合物（200℃～400℃），若需在較低的柱溫下分析，可采用低固定液配比1％～3%，采用高靈敏檢測器，柱溫可比沸點低100℃～150℃，在200℃～250℃的柱溫下分析。

⑵ 沸點＜300℃的樣品，可用3％～25%固定液配比。沸點越低，所用配比越高，柱溫可比平均沸點低50℃至平均沸點的范圍選擇。

3．載體選擇 載體采用低線速時，宜用氮氣；高線速時用氫氣。柱越長，柱內有較大壓力降，宜用氫氣。載氣采用低線速時為20ml～80ml/min。

4．其它條件

⑴ 氣化室溫度及檢測室溫度選擇：氣化溫度取決于樣品的揮發性、沸點、穩定性以及進樣量，一般選擇稍高于樣品沸點，但不要超過沸點50%以上，以防分解。檢測室溫度需高于柱溫，一般高于柱溫30℃左右或與氣化室同溫。

⑵ 進樣量：固定相在配比15％～35%的層析柱時，最大進樣量液體為10μl，氣體為10ml。一般樣品量液體4μl，氣體為0.5ml～3ml，固體小于1mg。

⑶ 橋電位選擇：散熱多和選擇大的橋電位，在靈敏度相同的情況下，應盡量選擇低橋電位，以保護熱敏元件。

（四）填充柱的制備

1．稱取一定量的載體于蒸發皿中，加2倍于載體體積的低沸點溶劑（氯仿丙酮、三氯甲烷等），使之溶解。

2．取適量的固定液，倒入蒸發皿中，拌勻。注意應使載體全部覆蓋在液面下，于紅外燈下緩緩加熱，不時輕輕攪拌，待溶液全部揮發。

3．先將柱的一端用玻璃毛輕輕堵上，接上吸濾真空泵，柱的另一端接上漏斗，將填充劑從漏斗加入，同時啟動真空泵，不時輕敲柱子各部，以使填充均勻。裝滿后，關閉真空泵，取下色譜柱，將加樣的一端也填上一小團玻璃毛。

4．將柱裝入色譜柱中，在通載氣前，先將爐溫升至略高于操作溫度，保持約1h，以使固定液受熱熔化或粘度減小，在載體表面流布均勻，然后再通入載氣，使色譜柱在操作溫度下，通載氣數小時。

（五）樣品處理

以細菌培養物樣品的處理為例。

1．取3～5個菌落，接種于2ml含有3%葡萄糖TSB肉湯（即含胰酶1.42%、植物胨 0.25%、K2H PO4 0.25%NaCl、0.42%的肉湯）內，35℃～38℃培養3h。

2．于培養物中加2ml 5Mol/L H2SO4、H2O和CH3OH（1︰3︰16），混合后，再加4ml醋酸乙脂浸取，混勻，靜置片刻。

3．4 000r/min離心15min，棄沉淀。

4．取上清液加等量乙醚提取，收集乙醚層。

5．于水層中再加上述比例的5 Mol/L H2 SO4、H2O和CH3OH混合物。

6．于混合物中加等量氯仿提取，分層，收集氯仿層，棄去水層。

7．將乙醚層與氯仿層合并，揮發濃縮至0.01ml,加10μg已二酸作內標物，再加20μg甲氯基胺－HCl。

8．于混合物中加0.2ml吡啶，再加0.2ml TRI－SIL－BSA和0.05ml TMOS，混勻，60℃孵育1h，離心，去沉淀。

9．上清即可制譜。

（六）操作方法

1．按流程圖并參考儀器使用說明書，將有關設備安裝好，檢查各系統各接頭是否漏氣，確定無誤后，可開始操作。

2．打開氣流總閥門，調節表頭上的減壓閥，使氣體壓力為22kg/cm2左右，調節穩壓器針形閥，使載氣流速控制在所需要的流速值。

3．加熱色譜柱至所需的柱溫并控制此溫（根據儀器恒溫箱的性能控制溫度波動值在一定的范圍之內，如±0.5℃）。一般所用的柱溫是在被分析物質的平均沸點左右或更低一些。若被分析物的沸程太寬，則可用程序升溫法來升高柱溫。

4．加熱進樣器（氣化室），使溫度高于樣品沸點的最高組分的沸點。

5．加熱檢測器恒溫箱，使溫度與柱溫一樣或高于一定的值。

6．氣流和溫度均達穩定后，給檢測器通電流。若采用氫火焰離子化檢測器則啟動微電流放大器部分。

7．調檢樣器為零點，待穩定后，即可開始進樣。

（七）結果分析

氣相色譜層析是一種分離分析的方法，因此它的特點是適合于多組分混合物的定性和定量分析。

1．定性 對于一已知范圍的混合物，用此法定性很容易，但對于范圍未知的混合物來說，則需要配合化學分析及其它儀器分析等。

⑴ 利用保留值定性法：同一種物質在一根層析柱上保留時間相同。取樣品各可能組分的純物質加入樣品中，混合進樣，對此加入后的色譜圖，若某色譜峰相對譜高，則該色譜峰的組分與純物質可能為同一物質。

⑵ 化學反應定性法：即把色譜柱的流出物，通過官能團試劑中，觀察試劑的顏色是否發生變化或是否有沉淀，而判斷該組分含什么官能團或屬于何類化合物。

⑶ 兩譜聯用定性法：即利用質譜儀、紅外分光光度計等來進行測定，定性。

2．定量 在實驗條件恒定時，峰面積或峰高與組分的含量成正比，因此可以利用峰面積或峰高面積或峰高來進行定量。對于微生物標本的氣相色譜分析常根據以下幾點來進行比較。

⑴ 峰的有無和峰的大小。

⑵ 按10個重復標本分析計算的平均t值（標準差）。

⑶ 同標準化合物的相對保留時間進行對比，而對某化合物做出鑒定。